膀胱癌組織中DNMT3b、TILs表達(dá)及與其預(yù)后的關(guān)系

宋淵博 張世仲 李繼團(tuán)

膀胱癌為泌尿系統(tǒng)常見惡性腫瘤,目前臨床治療膀胱癌患者主要以膀胱癌根治術(shù)治療,但術(shù)后腫瘤易復(fù)發(fā),因此通常在膀胱癌根治術(shù)后,需結(jié)合放化療治療,消除腫瘤細(xì)胞,延長患者生存周期,但放化療治療所用藥物劑量等需根據(jù)患者術(shù)后腫瘤情況決定,劑量少難以達(dá)到消除腫瘤細(xì)胞的作用,劑量大則副作用大,對(duì)患者正常組織細(xì)胞造成過大損傷,均不利于患者生存[1-2]。臨床放化療方案主要根據(jù)患者術(shù)前腫瘤病理分型、分期制定,但臨床手術(shù)效果等情況均存在個(gè)體差異,因此需要分子標(biāo)志物預(yù)估患者預(yù)后情況,有利于臨床治療方案的制定[3]。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b(DNMT3b)在多種腫瘤中均高表達(dá),具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長增殖作用[4]。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TILs)為腫瘤特異性細(xì)胞免疫的重要組成部分[5]。目前臨床較少研究分析膀胱癌組織中DNMT3b、TILs表達(dá)水平與膀胱癌患者預(yù)后情況的相關(guān)性。對(duì)此,本次研究回顧性分析我院79例膀胱癌患者的臨床資料,分析膀胱癌組織中DNMT3b、TILs表達(dá)水平與膀胱癌患者預(yù)后情況的關(guān)系,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年6月至2020年6月期間我院收治的79例膀胱癌患者,對(duì)其進(jìn)行回顧性分析。納入標(biāo)準(zhǔn):確診為膀胱癌[6];患者術(shù)前均未實(shí)施放化療治療;均實(shí)施膀胱癌根治術(shù)獲取病灶組織;臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):合并其他惡性腫瘤;術(shù)前已存在膀胱癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移;合并凝血障礙、免疫功能障礙等其他影響膀胱癌組織中DNMT3b、TILs表達(dá)水平的疾病;未完成隨訪。

79例患者根據(jù)其2年內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)情況分為未復(fù)發(fā)組(n=48)及復(fù)發(fā)組(n=31),未復(fù)發(fā)組患者男/女為25/23;平均年齡(49.55±4.39)歲;腫瘤直徑平均(3.16±0.74)cm;腫瘤分期:T1期16例,T2期20例,T3期12例。復(fù)發(fā)組患者男/女為17/14;平均年齡(50.02±4.43)歲;腫瘤直徑平均(3.09±0.71)cm;腫瘤分期:T1期9例,T2期14例,T3期8例。已免去知情同意及倫理審批。

1.2 檢測方法

膀胱癌組織中DNMT3b表達(dá)水平檢測:采用Western blot分析膀胱癌組織中DNMT3b表達(dá)水平。提取膀胱癌組織總蛋白,使用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離,采用半干轉(zhuǎn)膜法將總蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上,加入5%脫脂奶粉在室溫下封閉1 h,然后將其放入稀釋過的DNMT3b一抗中放置40 min,再進(jìn)行漂洗,然后將其放入二抗中放置30 min,再次漂洗,漂洗后進(jìn)行發(fā)光反應(yīng),并曝光,應(yīng)用Image pro plus軟件分析其積分光密度(IOD),以DNMT3b的IOD值與內(nèi)參的IOD值的比值作為膀胱癌組織中DNMT3b相對(duì)表達(dá)水平。

膀胱癌組織中TILs表達(dá)水平檢測:采用免疫組織化學(xué)PV二步法進(jìn)行檢測。將標(biāo)本制備成4 μm切片,脫蠟水化后加入過氧化氫溶液放置10 min,使用磷酸鹽緩沖溶液沖洗3次,置于檸檬酸鹽緩沖液中加熱20 min,自然冷卻后再次沖洗3次,加入TILs一抗,置于4 ℃下放置過夜,再次沖洗3次,加入二抗,反應(yīng)50 min,于室溫下避光顯色,顯色4 min左右終止顯色,以陽性染色的淋巴細(xì)胞個(gè)數(shù)檢測其浸潤情況,TILs水平=單個(gè)核炎性細(xì)胞所占面積/腫瘤內(nèi)總間質(zhì)面積×100%。

兩組患者術(shù)后均隨訪2年,每3個(gè)月入院復(fù)查1次,復(fù)查行彩超、膀胱鏡檢查,觀察其腫瘤復(fù)發(fā)情況。

1.3 觀察指標(biāo)

比較未復(fù)發(fā)組與復(fù)發(fā)組DNMT3b、TILs表達(dá)水平,使用COX模型分析膀胱癌組織中DNMT3b、TILs表達(dá)水平與腫瘤復(fù)發(fā)的相關(guān)性。使用受試者工作曲線(ROC)分析膀胱癌組織中DNMT3b、TILs表達(dá)水平聯(lián)合檢測對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)的預(yù)測價(jià)值。分別比較膀胱癌組織中不同DNMT3b表達(dá)水平、不同TILs表達(dá)水平患者無瘤生存期(DFS)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組膀胱癌組織中DNMT3b、TILs表達(dá)水平比較

未復(fù)發(fā)組DNMT3b表達(dá)水平顯著低于復(fù)發(fā)組,TILs表達(dá)水平顯著高于復(fù)發(fā)組(P<0.05),見表1。

表1 兩組膀胱癌組織中DNMT3b、TILs表達(dá)水平比較

2.2 膀胱癌組織中DNMT3b、TILs表達(dá)水平與腫瘤復(fù)發(fā)的相關(guān)性分析

經(jīng)COX相關(guān)性模型分析,膀胱癌組織中DNMT3b表達(dá)水平與腫瘤復(fù)發(fā)呈正相關(guān),TILs表達(dá)水平與腫瘤復(fù)發(fā)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),見表2。

表2 相關(guān)性分析

2.3 DNMT3b、TILs表達(dá)水平聯(lián)合檢測對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)的預(yù)測價(jià)值

ROC曲線中,膀胱癌組織中DNMT3b、TILs表達(dá)水平聯(lián)合預(yù)估腫瘤復(fù)發(fā)的AUC為0.855,敏感度為85.42%,特異度為77.42%,見圖1、表3。

圖1 ROC曲線

表3 ROC曲線參數(shù)

2.4 膀胱癌組織中DNMT3b不同表達(dá)水平患者DFS比較

DNMT3b高表達(dá)患者平均DFS為22.27個(gè)月(95%CI=21.540～22.993),DNMT3b低表達(dá)患者平均DFS為23.08個(gè)月(95%CI=22.710～23.446),高表達(dá)患者DFS顯著短于低表達(dá)者(Log Rank χ2=5.759,P=0.016),見圖2。

圖2 膀胱癌組織中不同DNMT3b表達(dá)水平患者DFS比較

2.5 膀胱癌組織中TILs不同表達(dá)水平患者DFS比較

TILs高表達(dá)患者平均DFS為23.13個(gè)月(95%CI=22.781～23.482),TILs低表達(dá)患者平均DFS為22.22個(gè)月(95%CI=21.429～23.016),高表達(dá)患者DFS顯著長于低表達(dá)者(Log Rank χ2=7.348,P=0.007),見圖3。

圖3 膀胱癌組織中不同TILs表達(dá)水平患者DFS比較

3 討論

膀胱癌患者經(jīng)膀胱癌根治術(shù)后,由于部分腫瘤細(xì)胞無法通過手術(shù)切除,術(shù)后仍需實(shí)施放化療,而放化療方案直接影響患者預(yù)后情況,腫瘤分期以及手術(shù)腫瘤切除情況難以準(zhǔn)確預(yù)測患者預(yù)后情況,因此臨床需研究分子指標(biāo)預(yù)測患者預(yù)后情況,為臨床放化療方案制定提供參考依據(jù)[7]。

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為,各種因素導(dǎo)致人體DNA序列改變,引發(fā)細(xì)胞增殖分化異變,最終造成惡性腫瘤形成,而DNMT3b為甲基化轉(zhuǎn)移酶,是基因表達(dá)調(diào)控的重要方式之一,對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞分化至關(guān)重要,與腫瘤形成密切相關(guān),已在多種惡性腫瘤中明顯高表達(dá)[8]。TILs為存在腫瘤間質(zhì)內(nèi)的特異淋巴細(xì)胞,可殺傷腫瘤細(xì)胞活性[9]。本次研究結(jié)果中,未復(fù)發(fā)組患者膀胱癌組織中DNMT3b表達(dá)水平顯著低于復(fù)發(fā)組患者,TILs表達(dá)水平顯著高于復(fù)發(fā)組患者;經(jīng)COX相關(guān)性分析模型分析,膀胱癌組織中DNMT3b表達(dá)水平與膀胱癌患者腫瘤復(fù)發(fā)呈正相關(guān),TILs表達(dá)水平與膀胱癌患者腫瘤復(fù)發(fā)呈負(fù)相關(guān),說明膀胱癌組織中DNMT3b表達(dá)水平水平上升、TILs表達(dá)水平下降與膀胱癌患者預(yù)后情況密切相關(guān)。原因在于,DNMT3b為從頭開始的甲基化轉(zhuǎn)移酶,可逆轉(zhuǎn)部分基因甲基化水平降低現(xiàn)象,通過調(diào)控促凋亡基因的甲基化水平促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長增殖,從而影響膀胱癌患者腫瘤復(fù)發(fā)[10]。TILs為人體免疫系統(tǒng)中抗腫瘤T細(xì)胞的主要功能細(xì)胞,可針對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫,殺死腫瘤細(xì)胞同時(shí)分泌有利于抑制腫瘤細(xì)胞活性的細(xì)胞因子,抑制腫瘤進(jìn)展,可一定程度反應(yīng)膀胱癌患者機(jī)體對(duì)于腫瘤細(xì)胞的免疫水平,因此與患者腫瘤復(fù)發(fā)密切相關(guān)[11]。

腫瘤細(xì)胞復(fù)發(fā)情況直接影響膀胱癌患者生存時(shí)間等[12]。本次研究結(jié)果中,ROC曲線中,膀胱癌組織中DNMT3b、TILs表達(dá)水平聯(lián)合預(yù)估膀胱癌患者腫瘤復(fù)發(fā)的AUC為0.855,敏感度為85.42%,特異度為77.42%;DNMT3b高表達(dá)患者DFS顯著低于DNMT3b低表達(dá);TILs高表達(dá)患者DFS顯著高于TILs低表達(dá),說明當(dāng)膀胱癌組織中DNMT3b表達(dá)水平≤6.05、TILs表達(dá)水平≥47.69%時(shí),患者腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)低,且生存期延長。因?yàn)楫?dāng)膀胱癌組織中DNMT3b表達(dá)水平低、TILs表達(dá)水平高時(shí),說明癌細(xì)胞增殖分化能力較差,且膀胱癌患者機(jī)體自身抗腫瘤免疫能力較強(qiáng),可一定程度抵抗腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,臨床適當(dāng)給予放化療進(jìn)一步殺死癌細(xì)胞,則可延長患者生存周期[13]。

本研究尚有不足之處,研究納入病例較少,且膀胱癌患者預(yù)后情況可能受到術(shù)后是否按時(shí)治療等主觀因素影響,臨床可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量,限制樣本納入范圍,進(jìn)一步研究分析膀胱癌組織中DNMT3b、TILs表達(dá)水平與患者生存時(shí)間的關(guān)系。

綜上所述,膀胱癌組織中DNMT3b、TILs表達(dá)水平與患者腫瘤復(fù)發(fā)具有相關(guān)性,用于預(yù)估其腫瘤復(fù)發(fā)情況具有較好預(yù)測價(jià)值,可為臨床提供客觀參考依據(jù),輔助臨床醫(yī)師制定膀胱癌患者治療方案,延長患者生存周期。