TRIM59,EIF5A2在非小細胞肺癌組織中的表達及對轉移分化的預估價值

王玉文 周雅琪 宋宗義 趙云龍

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)在肺癌中占比高達80%以上,有生長慢、轉移擴散晚的特點[1]。近年來,NSCLC五年生存率仍無重大突破,從分子生物學方向尋找高特異性、高敏感度的標志物用于NSCLC早期診斷、預后監測,已成為醫學界研究熱點[2]。前期經第二代測序技術發現三結構域蛋白59(tripartite motif-59,TRIM59)和真核翻譯起始因子5A2(eukaryotic translation initiation factor 5A2,EIF5A2)等在癌組織中表達升高,對NSCLC轉移分化有促進作用。Shen等[3]報道TRIM59是一種癌基因,在膽管癌發生和增殖等過程中發揮重要作用。EIF5A2為癌細胞增殖過程中的上游調控因子之一,可促進腫瘤發生發展[4]。但關于TRIM59、EIF5A2在NSCLC中表達水平是否能作為患者腫瘤轉移分化的預估標志物,相關報道鮮見,故開展本次實驗。

1 材料與方法

1.1 病例材料

選取2018年1月至2019年1月經我院病理確診的NSCLC組織與正常肺組織標本各80例,同時收集相應患者完整的臨床資料。本研究經我院倫理委員會批準。

1.2 實驗方法

1.2.1 qRT-PCR法檢測NSCLC組織與正常組織中TRIM59、EIF5A2 mRNA表達 將組織樣本液氮研磨,提取RNA,反轉錄為cDNA,用qRT-PCR試劑盒(日本TAakara公司)進行PCR實驗。20 μL反應體系:cDNA 2 μL,上下游引物各2 μL,無酶水3.6 μL,ROX 0.4 μL,SYBR?Premix Ex TaqTM10 μL。反應步驟:預變性95 ℃ 6 min,變性95 ℃ 30 s,退火65 ℃ 35 s,延伸72 ℃ 20 s,共40個循環。每個樣本設置重復3次,以GAPDH為內參基因,計算TRIM59、EIF5A2 mRNA相對表達量,用2-△△Ct公式計算。TRIM59引物:上游5′-TTGATCTCGTGGTTTGGGGG-3′,下游5′-ACTGTGTTGGTGTTTGTGGC-3′;EIF5A2引物:上游5′-TGGGCCCGTTATTTCTGCAT-3′,下游5′-CAGGTTCTGTTACCCCGCAT-3′;GAPDH引物:上游5′-GCAACTAGGATGGTGTGGCT-3′,下游5′-TCCCATTCCCCAGCTCTCATA-3′。

1.2.2 免疫組化法檢測NSCLC組織與正常組織中TRIM59、EIF5A2 蛋白表達 將組織用10%甲醛固定,石蠟包埋,制作4 μm厚的切片,脫蠟至水,浸于乙二胺四乙酸溶液中,微波抗原修復10 min,冷卻至室溫,水洗,PBS浸洗,滴加山羊血清封閉液,室溫封閉18 min,甩去多余液體,加入鼠抗人TRIM59、EIF5A2一抗(ABcam),4 ℃過夜,PBS清晰,滴加SP 900通用型生物素標記二抗(Thermo Fisher Scientific),37 ℃下孵育1 h。二氨基聯苯胺顯色,蘇木精復染,脫水,透明,封片。對照設置為正常小鼠血清取代一抗進行替代對照,用PBS作空白對照。染色陽性結果判斷:TRIM59、EIF5A2在細胞膜或細胞質內出現彌漫性分布的棕色、棕黃色顆粒即陽性細胞,按半定量積分法根據染色強度、陽性細胞所占比例計分:染色強度分為未著色、淺著色、重度著色、深度著色,依次評分為0、1、2、3分;陽性細胞百分率:高倍鏡(×400)下隨機選取5個視野,每個視野計數100個細胞,計算腫瘤細胞平均陽性百分率,陽性細胞數分為≤5%、>5%～25%、>25%～49%、≥50%,依次評分為0、1、2、3分。兩項評分相加,0～1分、2分、3～4分、5～6分依次為(-)、(+)、(++)、(+++),(-)表示陰性,(+)～(+++)表示陽性。將兩項計分相乘,≤3分為低表達,>3分為高表達。

1.3 隨訪及研究方法

經門診復查和電話隨訪,獲得患者預后情況,隨訪時間為3年,期間無脫落病例。根據患者是否出現轉移分化分為轉移分化組、未轉移分化組,收集患者性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度、腫瘤位置、臨床分期、浸潤程度、淋巴結轉移等情況,比較組間差異,并選取有統計學差異的參數進行多因素logistic回歸分析;繪制受試者工作特征曲線(Receiver Operating Characteristic,ROC)及曲線下面積(Area Under Curve,AUC),分析TRIM59、EIF5A2 蛋白表達水平對肺癌患者轉移分化的預估價值。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 NSCLC組織與正常組織中TRIM59、EIF5A2 mRNA表達水平

NSCLC組織中TRIM59、EIF5A2 mRNA表達水平高于正常組織,比較差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 NSCLC組織與正常組織中TRIM59、EIF5A2 mRNA表達水平

2.2 NSCLC組織與正常組織中TRIM59、EIF5A2 蛋白表達水平

NSCLC組織中TRIM59、EIF5A2蛋白高表達率高于正常組織,比較差異有統計學意義(P<0.05),見表2。

表2 NSCLC組織與正常組織中TRIM59、EIF5A2 蛋白表達水平(例,%)

2.3 轉移分化組與未轉移分化組患者臨床資料比較

80例肺癌患者經隨訪發現,轉移分化15例。

轉移分化組與未轉移分化組患者之間的TRIM59、EIF5A2蛋白表達情況、腫瘤分化程度差異有統計學意義(P<0.05),性別、年齡、臨床分期、淋巴結轉移以及腫瘤直徑等差異無統計學意義(P>0.05),見表3。

表3 轉移分化組與未轉移分化組患者臨床資料比較/例

2.4 多因素Logistic回歸分析

以TRIM59、EIF5A2蛋白表達情況和腫瘤分化程度為自變量,以患者是否發生腫瘤轉移分化為因變量(發生=1,未發生=0),進行多因素logistic回歸分析,結果提示TRIM59、EIF5A2蛋白高表達和腫瘤低分化為NSCLC腫瘤轉移分化的危險因素。見表4。

表4 NSCLC患者發生轉移分化的影響因素的多因素Logistic回歸分析

2.5 TRIM59、EIF5A2 蛋白表達水平對肺癌患者轉移分化的預估價值

NSCLC組織中TRIM59聯合EIF5A2 蛋白表達水平預估腫瘤轉移分化的AUC及特異度均明顯高于單獨檢測,而敏感度與TRIM59單獨檢測無差異。詳見表5、圖1。

圖1 TRIM59、EIF5A2 蛋白表達水平對肺癌組患者轉移分化的預估價值

表5 TRIM59、EIF5A2 蛋白表達水平與肺癌組患者腫瘤轉移分化的預估價值

3 討論

NSCLC的發生發展機制尚不明確,主要采取手術、化療以及放療等控制腫瘤遷移分化,但上述傳統療法效果欠佳,患者往往因轉移分化等原因死亡[5]。因此,分析腫瘤轉移分化的分子機制,探索其潛在治療靶點十分關鍵,對改善NSCLC療效有重要意義。

TRIM家族蛋白為E3泛素連接酶重要成員,已被證明其在腫瘤發生發展中參與了細胞信號傳導、調控腫瘤相關分子表達等作用,這為研究TRIM家族蛋白在NSCLC中的作用機制提供了科學依據[6]。TRIM59蛋白是TRIM59基因編碼的蛋白質,有RING結構域、E3泛素連接酶活性,在多個病理生理過程中扮演了角色[7]。Tong等[8]報道TRIM59基因擴增在卵巢癌組織中普遍存在,且其擴增與較差的總體生存率顯著相關。Liu等[9]表明TRIM59對食管癌進展有促進作用。EIF5A2是參與多種細胞轉錄、翻譯和核質互換等過程的蛋白,在膽囊癌[10]、前列腺癌[11]等多種人類腫瘤中表達異常升高。在本研究中,經qRT-PCR檢驗發現,NISCLC組織中TRIM59、EIF5A2 mRNA表達水平明顯高于正常組織;免疫組織化學染色觀察樣本切片TRIM59蛋白主要表達于腫瘤細胞的細胞質,EIF5A2蛋白表達于腫瘤細胞的細胞質與細胞核,二者蛋白均呈高表達狀態,提示TRIM59、EIF5A2在NSCLC組織中表現為異常高表達。Yang等[12]報道EIF5A2過表達可能導致癌癥進展,并證明EIF5A2可能是FIGOⅠ～Ⅱ期宮頸癌的一種新的潛在預后標志物。Liu等[13]表明TRIM59過表達與不良預后相關,Guo等[14]報道通過薈萃分析評估TRIM59與肺癌預后的關系,發現TRIM59有預測肺癌患者預后的生物標志物的潛在價值。

了解TRIM59、EIF5A2在NSCLC組織中表達譜后,本研究進一步探索其對預后評估的作用。由于腫瘤轉移分化是患者治療失敗、死亡的主要原因,因此將NSCLC組織對應患者按是否發生轉移分化進行分組,并比較2組患者臨床資料,結果顯示:轉移分化組患者中TRIM59、EIF5A2蛋白高表達者和腫瘤低分化者占比高于未轉移分化組。將TRIM59、EIF5A2蛋白表達以及腫瘤分化作為自變量,代入logistic回歸模型分析發現TRIM59、EIF5A2蛋白高表達及腫瘤低分化是NSCLC患者發生轉移分化的危險因素,初步確立了TRIM59、EIF5A2蛋白表達水平在NSCLC轉移分化發生過程中的作用。關于腫瘤低分化是影響NSCLC預后的獨立危險因素這一點已有相關研究證明[15]。Lou等[16]認為TRIM59作為預測NSCLC患者預后的新型分子生物標志物,He等[17]報道EIF5A2 的過表達是Ⅰ期非小細胞肺癌患者生存的不良預后標志物,上述研究表明NSCLC組織中TRIM59、EIF5A2表達水平可能作為用于評估患者預后的標志物,本研究結果與上述研究存在一致性。因本研究進行單因素與多因素Logistic回歸分析時納入因素相對較少,樣本量較小,分析結果可能存在誤差,因而該結論有必要進行進一步證實。ROC曲線分析發現,NSCLC組織中TRIM59、EIF5A2蛋白表達情況對腫瘤轉移分化有一定預估價值,二者聯合用于評估轉移分化的AUC以及敏感度、特異度高于單獨檢測,這一點可為臨床評估NSCLC患者預后提供指導。

綜上所述,NSCLC組織中TRIM59、EIF5A2表達水平異常升高,是NSCLC發生轉移分化的危險因素,可作為患者預后評估的重要標志物。但二者具體價值仍需將來納入更多可能的影響因素和擴大樣本量進行驗證。