右美托咪定通過HIF-1α信號通路對缺氧誘導的結直腸癌細胞增殖和侵襲的影響

李興曉 彭會麗 陳祖濤

隨著飲食結構和環境因素變化,我國結直腸癌的發病率呈逐年上升趨勢,具有較高的死亡率,嚴重威脅著人類健康[1]。缺氧微環境是維持癌細胞干性的外在環境,由于腫瘤細胞的快速生長,使得血液供應難以為繼,使得腫瘤部分區域氧濃度低于正常組織。而缺氧微環境是導致腫瘤發生耐藥性、血管再生、抑癌基因丟失等的重要因素,同時也是癌細胞發生轉移以及嚴重不良預后的重要原因[2-3]。研究發現,缺氧環境下,乳腺癌細胞上皮間質轉化進程加快[4]。此外,缺氧環境誘導肝細胞癌血管形成,促進肝癌的進展[5]。缺氧微環境下,缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表達增加,可促進VEGF表達影響腫瘤血管生成[6]。有研究指出,右美托咪定對結直腸癌大鼠具有抗癌作用[7]。但是,目前右美托咪定是否對缺氧環境下結直腸癌細胞發揮抗癌作用仍有待研究,因此本研究探討右美托咪定對缺氧環境中結直腸癌Caco2細胞增殖和侵襲的影響以及對HIF-1α信號通路的調節作用。

1 材料與方法

1.1 細胞系

人結腸腺癌Caco2細胞購自上海中國科學研究院細胞研究所。

1.2 試劑和儀器

右美托咪定購自山東辰熙醫藥科技有限公司;胎牛血清和培養基購自Gibco公司;Transwell小室和Matrigel基質膠購自美國Coring公司;HIF-1α引物序列由廣州銳博生物科技有限公司合成;逆轉錄以及PCR試劑盒購自Promega公司;兔抗人HIF-1α抗體和HRP標記的山羊抗兔IgG二抗購自美國Abcam公司;CCK8試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司;Herocell 180二氧化碳恒溫培養箱購自上海潤度生物科技有限公司;XBL-01低氧培養箱購自杭州艾普儀設備有限公司;STM6光學顯微鏡購自奧林巴斯。

1.3 細胞培養

Caco2細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中,置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫培養箱中,2 d更換一次培養液,細胞鋪滿培養皿底部時進行消化傳代。取第3代細胞進行實驗。

1.4 CCK-8檢測細胞增殖活性

取對數期細胞,制成單細胞懸液,以每孔5×103個細胞的密度接種于24孔板,并分成2組,常氧組和缺氧組。常氧組細胞置于37 ℃、5% CO2、20% O2的培養箱中,缺氧組細胞置于37 ℃、5% CO2、1% O2、94% N2的低氧培養箱中培養,每組設置5個復孔,同時設置空白孔。分別在12 h、24 h和48 h后每孔加入CCK8工作液10 μL,置于培養箱中繼續培養4 h,置于酶標儀上,測定450 nm波長處吸光度(A)值,計算細胞增殖活性(%)=(A實驗孔-A空白孔/A對照孔-A空白孔)×100%。

1.5 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力

取處于對數生長期的Caco2細胞,胰蛋白酶消化,制成1×105個/mL的細胞懸液。取200 μL細胞懸液加入到鋪滿基質膠的上室中,下室中加入完全培養基600 μL,將小室分別置于常氧和缺氧的培養箱中培養,24 h后,取出小室,4%多聚甲醛固定,0.1%結晶紫染色,顯微鏡下觀察并計數。

1.6 qRT-PCR檢測HIF-1α和VEGF mRNA表達水平

將細胞按照1.4的方法進行分組處理,Trizol法提取細胞中總RNA水平,并逆轉錄成cDNA,取1 μg cDNA為模板進行PCR反應,反應體系設為20 μL:2 μL cDNA,10 μLSYBR Green Mix,0.4 μL ROX Reference Dye,上下游引物各0.8 μL,6 μL無核酶水。95℃預變性 5 min,95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共進行40個循環。2-△△CT法計算目的基因表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 蛋白印跡法檢測HIF-1α和VEGF 蛋白表達水平

將細胞按照1.4的方法進行分組處理,RIPA裂解液裂解,離心取上清液,BCA法測定蛋白濃度,蛋白樣品煮沸變性。50 μg蛋白上樣電泳,將蛋白濕轉至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉,4 ℃ HIF-1α和GAPDH抗體孵育過夜,二抗孵育,ECL法顯色,Image J分析條帶灰度值,HIF-1α/VEGF蛋白表達水平=HIF-1α/VEGF條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.8 右美托咪定對Caco2細胞增殖、侵襲和HIF-1α及VEGF mRNA和蛋白表達水平的影響

1.8.1 細胞分組 取對數期Caco細胞,制成1×105個/mL的單細胞懸液,取100 μL接種于96孔板,將培養板置于缺氧培養箱中培養,細胞貼壁生長后,換用含不同濃度右美托咪定的培養基(0,5,10,20,40 μmoL)培養24 h。

1.8.2 CCK-8檢測細胞增殖活性 取1.8.1中經不同濃度右美托咪定培養的細胞,按照1.4的方法檢測細胞增殖活性。

1.8.3 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 取1.8.1中經不同濃度右美托咪定培養的細胞,按照1.5的方法檢測細胞侵襲細胞數。

1.8.4 qRT-PCR檢測HIF-1α和VEGF mRNA表達水平 取1.8.1中經不同濃度右美托咪定培養的細胞,按照1.6的方法檢測HIF-1α mRNA表達水平。

1.8.5 蛋白印跡法檢測HIF-1α和VEGF 蛋白表達水平 取1.8.1中經不同濃度右美托咪定培養的細胞,按照1.6的方法檢測HIF-1α 蛋白表達水平。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 缺氧條件下細胞增殖活性檢測結果

缺氧組細胞在12 h、24 h和48 h的增殖活性均顯著高于常氧組(P<0.05)。見表2。

表2 細胞增殖活性比較

2.2 缺氧條件下侵襲細胞數檢測結果

缺氧組侵襲細胞數顯著多于常氧組(P<0.05)。見表3。

表3 侵襲細胞數比較

2.3 缺氧條件下HIF-1α 和VEGF mRNA及蛋白表達水平檢測結果

缺氧組HIF-1α和VEGF mRNA及蛋白表達水平均高于常氧組(P<0.05)。見表4,圖1。

圖1 缺氧條件下細胞內HIF-1α蛋白表達水平

表4 HIF-1α 和VEGF mRNA及蛋白表達水平

2.4 右美托咪定對細胞增殖活性的影響

細胞增殖活性隨右美托咪定濃度的升高逐漸降低,且具有濃度依賴性(P<0.05),見表5。

表5 不同濃度右美托咪定對細胞增殖活性的影響

2.5 右美托咪定對侵襲細胞數的影響

侵襲細胞數隨右美托咪定濃度的升高逐漸減少,且具有濃度依賴性(P<0.05),見表6。

表6 不同濃度右美托咪定對侵襲細胞數的影響

2.6 右美托咪定對HIF-1α和VEGF mRNA及蛋白表達水平的影響

HIF-1α和VEGF mRNA及蛋白表達水平隨右美托咪定濃度的升高逐漸降低,且具有濃度依賴性(P<0.05)。見表7,圖2。

圖2 不同濃度右美托咪定對HIF-1α和VEGF蛋白表達水平的影響

表7 不同濃度右美托咪定對HIF-1α和VEGF mRNA及蛋白表達水平的影響

3 討論

腫瘤微環境是腫瘤細胞賴以生存的內環境,腫瘤生長過程中,腫瘤細胞的快速增殖超過腫瘤血管的新生速度,腫瘤細胞周圍毛細血管內氧含量不能滿足腫瘤生長的需求,導致毛細血管內氧和營養成分供應不足,因此形成腫瘤缺氧微環境[8]。HIF-1α作為低氧適應性介導者,通過激活血管形成信號通路相關基因VEGF,可促進腫瘤血管新生,進而為腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲提供能量基礎[9]。研究發現,HIF-1α可促進缺氧環境下胰腺癌細胞遷移和侵襲[10]。Li等研究發現,HIF-1α和VEGF活化可促進血管生成,從而加快肺癌進程[11]。miR-148a通過下調缺氧環境中HIF-1α和VEGF的高表達狀態,可抑制血管生成和重塑,誘導結腸癌凋亡,發揮抗結腸癌的作用[12]。本研究將結直腸癌Caco2細胞分為常氧組和缺氧組,姐測結果顯示:缺氧組細胞在12 h、24 h和48 h的增殖活性均高于常氧組,侵襲細胞數少于常氧組,說明缺氧微環境下結直腸癌細胞增殖和侵襲能力增強。與常氧組比較,缺氧組細胞中HIF-1α和VEGF的mRNA水平和蛋白表達水平均降低,說明缺氧環境下,HIF-1α/VEGF信號通路被激活。

右美托咪定在抗腫瘤中的作用以多有報道,Zhang等[13]研究表明,右美托咪定可抑制食管癌生長和轉移。Gao等[14]研究發現,右美托咪定通過誘導鐵死亡發揮抗胃癌作用。此外,右美托咪定可抑制缺氧誘導的肝癌細胞增殖活性和血管生成能力[15]。本研究中在缺氧條件下,細胞增殖活性、侵襲細胞數隨右美托咪定濃度的升高逐漸降低,且具濃度依賴性,說明右美托咪定可抑制缺氧誘導的結直腸癌細胞增殖和侵襲。多項研究表明,右美托嘧啶可調節HIF-1α和VEGF表達活性,在糖尿病腎損傷大鼠模型中,右美托咪定可通過下調HIF-1α表達抑制氧化應激反應,從而改善肺功能[16]。Wang等[17]研究表明,右美托咪定通過抑制HIF-1α表達可改善缺血再灌注引起的腦損傷。本研究結果顯示:HIF-1α和VEGF mRNA水平和蛋白表達水平隨右美托咪定濃度的升高逐漸降低,且具有濃度依賴性。說明右美托咪定可抑制缺氧條件下結直腸癌細胞HIF-1α和VEGF的活性。

綜上所述,右美托咪定可抑制缺氧誘導的結直腸癌細胞增殖和侵襲,其可能是通過下調癌細胞中HIF-1α和VEGF的表達發揮作用,為臨床治療結直腸癌提供理論依據。但是本研究仍存在不足之處,首先對右美托咪定在缺氧條件下發揮抗結直腸癌的具體機制研究不夠深入,下一步將探討其是否通過調節HIF-1α對血管生成具有影響。其次,本研究僅限于細胞水平,下一步將從動物實驗進行探討。