紫草素通過Keap1/Nrf2通路對膀胱癌細胞惡性增殖及凋亡的影響及作用機制

劉增振 牛秋霞 孟慶澤 陳曉增 石 峰 董新強

膀胱癌(bladder cancer,BC)是泌尿生殖系統常見腫瘤,發病率居全球第11位[1]。由于吸煙和職業接觸各種化學致癌物等因素,BC發病率逐年上升,目前手術、免疫治療、放療和輔助化療為BC治療的主要方法,但其預后總體不佳,BC患者5年相對生存率約為70%[2-3],因此,深入探索BC發病分子機制,積極尋找安全、有效的替代療法,對于遏制BC惡性進展、提高患者治愈率和生存率具有重要意義。

據報道,氧化還原失衡與BC發生和發展有關,細胞抗氧化酶的破壞或抑制會增加活性氧(reactive oxygen species,ROS)產生,從而引發惡性細胞的凋亡[4]。Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1/核因子E2相關因子2(Kelch like epichlorohydrin associated protein-1/nuclear factor E2 associated factor 2,Keap1/Nrf2)通路在細胞氧化還原穩態中起關鍵作用,其中Nrf2是細胞抗氧化劑的關鍵調節因子,可防止ROS積累,在多種類型的腫瘤中被激活[5],提示該通路可能參與調節BC細胞的惡性增殖及抗凋亡特性。據報道,紫草素可抑制BC細胞增殖、遷移與侵襲,并促進凋亡[6],但紫草素對BC細胞的增殖及凋亡干預作用是否與調控Keap1/Nrf2通路有關,目前報道較少,故本研究擬通過體外培養BC細胞株T24并加以紫草素培養作用,探討紫草素對T24細胞增殖及凋亡的影響及可能作用機制,以期為BC治療提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 T24人BC(CL-0227)購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2 試劑和儀器 紫草素(純度98%)(517-89-5)購自南京道斯夫生物科技有限公司;AnnexinV-FITC/PI流式細胞凋亡檢測試劑盒(KGA106)購自南京凱基生物科技公司;ROS熒光探針DCFH-DA(KM0062)購自北京百奧萊博科技有限公司;丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒(S0131S)購自上海碧云天生物技術有限公司;還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)檢測試劑盒(BC1170)購自北京索萊寶科技有限公司;兔抗Nrf2多克隆抗體(ab92946),兔抗Keap1(ab227828)、血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)(ab52947)及醌氧化還原酶1(quinone oxidoreductase 1,NQO1)(ab80588)單克隆抗體均購自美國Abcam公司;ABI 7300型實時熒光定量PCR系統購自美國ABI公司;550型全自動酶標儀購自美國Bio-Rad公司;Gel Doc XR+凝膠成像分析系統購自美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞復蘇、培養 含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養液復蘇T24細胞,于體積分數為5% CO2、飽和濕度的37 ℃培養箱中培養,傳代2～3次。

1.2.2 CCK8法檢測不同濃度紫草素對T24細胞的增殖抑制作用 收集細胞沉淀,利用含0(對照組)、10、20、40及80 μmoL/L紫草素(實驗組)培養液重懸,于96孔板每孔接種5×103個細胞并培養。48 h后各孔均加入10 μL CCK8溶液,培養箱內靜置2 h,利用酶標儀于450 nm處測定各孔吸光度(OD)值,細胞存活率(%)=實驗組OD值/對照組OD值×100%。重復3次。

1.2.3 克隆形成測定細胞集落形成能力 利用含0、10、20、40、80 μmoL/L紫草素的完全培養液重懸對數期T24細胞并接種至6孔板中(每孔1×103個細胞),每3天更換一次培養液,培養2周,4%多聚甲醛溶液固定30 min,0.1%結晶紫溶液染色30 min,鏡下對超過50個細胞的菌落進行計數,重復3次。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 利用含0、10、20、40、80 μmoL/L紫草素的完全培養液重懸對數期T24細胞并接種至6孔板中(每孔1×106個細胞),連續培養48 h。胰蛋白酶消化收集細胞,PBS洗滌2次,結合緩沖液重懸,后與5 μL Annexin V-FITC在4 ℃下孵育15 min,5 μL PI避光孵育5 min,流式細胞儀檢測細胞凋亡率,重復3次。

1.2.5 熒光探針檢測細胞內ROS生成水平 收集T24細胞,以每孔5×103個細胞接種于96孔板,對應培養液培養48 h。10 μM DCFH-DA重懸并于37 ℃下避光染色30 min,后利用無血清RPMI-1640培養液洗滌3次,熒光顯微鏡下觀察利用酶標儀于激發波長為488 nm和發射波長為525 nm下檢測DCF熒光強度以評估ROS生成水平,ROS生成水平計算為實驗組熒光強度/對照組熒光強度,此處對照組為0 μmoL/L紫草素作用下的細胞。

1.2.6 比色分析法檢測細胞MDA及GSH含量 利用含0、10、20、40、80 μmoL/L紫草素的完全培養液調整對數期T24細胞密度為1×106個/mL,接種5 mL至75 cm2培養中,連續培養48 h。收集細胞,12000 r/min離心10 min后取上清,BCA法檢測蛋白濃度,后加入MDA檢測工作液,于沸水中保持15 min并冷卻至室溫,最后測量532 nm處的吸光度并標準化為蛋白質濃度來評估MDA水平;收集細胞,PBS洗滌2次,將細胞樣品用液氮和37 ℃水浴快速冷凍和解凍2次,12000 r/min離心10 min后取上清,用供試液處理,最后測量412 nm處的吸光度,根據吸光度和濃度做出標準曲線,并評估GSH水平。

1.2.7 RT-qPCR技術檢測相關因子mRNA相對表達水平 Trizol試劑提取各組細胞總RNA,使用逆轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA,制備RT-qPCR反應體系,上機進行RT-qPCR定量檢測。反應條件為95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s 、60 ℃ 30 s 40個循環。以β-actin為內參,2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達量。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計,序列如下:Keap1:F:5'-GGAGGCGGAGCCCGA-3',R:5'-GATGCCCTCAATGGA CAACCA-3';Nrf2:F:5'-ACACGGTCCACAGCTCATC-3',R:5'-TGTCAATCAAAT CCATGTCCTG-3';β-actin:F:5'-CCCACACTGTGCCCATCTAC-3',R:5'-GGAACC GCTCATTGCCAATG-3'。

1.2.8 WB檢測通路相關蛋白相對表達情況 收集各組細胞沉淀,RIPA裂解緩沖液提取細胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,SDS-PAGE電泳凝膠分離蛋白并轉移至PVDF膜上,5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h,后與一抗(均1∶1000稀釋)4 ℃孵育過夜,洗膜,辣根過氧化物酶偶聯的二抗(1∶10000稀釋)室溫孵育1 h,洗膜,ECL發光液可視化條帶,化學凝膠成像系統曝光,Image J分析條帶灰度值,以目的蛋白與內參β-actin的灰度值比值表示蛋白相對表達量。

1.3 統計分析

2 結果

2.1 紫草素對T24細胞增殖、集落形成及凋亡的影響

T24細胞存活率、集落形成數隨紫草素作用濃度增加而降低,細胞凋亡率隨紫草素作用濃度增加而升高(P<0.05)。見圖1、2,表1。

表1 不同濃度紫草素培養下T24細胞存活率、凋亡率及集落形成數比較

圖2 流式細胞儀檢測紫草素各濃度下T24細胞凋亡情況

2.2 紫草素對T24細胞內ROS生成水平及MDA、GSH含量的影響

T24細胞內ROS生成水平、MDA含量隨紫草素作用濃度增加而升高,GSH含量隨紫草素作用濃度增加而降低(P<0.05)。見圖3,表2。

表2 不同濃度紫草素培養下T24細胞ROS生成水平及MDA、GSH含量比較

圖3 不同濃度紫草素作用下的T24細胞DCF熒光觀察(×200)

2.3 紫草素對T24細胞Keap1、Nrf2 mRNA相對表達水平的影響

T24細胞中Keap1 mRNA相對表達水平隨紫草素作用濃度增加而升高,Nrf2 mRNA相對表達水平隨紫草素作用濃度增加而降低(P<0.05)。見表3。

表3 不同濃度紫草素作用下T24細胞Keap1、Nrf2 mRNA相對表達水平比較

2.4 紫草素對T24細胞Keap1/Nrf2相關蛋白表達的影響

T24細胞中Keap1蛋白相對表達量隨紫草素作用濃度增加而升高,Nrf2、HO-1及NQO1蛋白相對表達量均隨紫草素作用濃度增加而降低(P<0.05)。見圖4,表4。

表4 不同濃度紫草素作用下T24細胞Keap1、Nrf2、HO-1及NQO1蛋白相對表達量比較

注:A:0 μmoL·L-1紫草素;B:10 μmoL·L-1紫草素;C:20 μmoL·L-1紫草素;D:40 μmoL·L-1紫草素;E:80 μmoL·L-1紫草素。

3 討論

紫草素是從紫草干燥根中提取分離而來的一種天然萘醌化合物[7],越來越多的證據表明,紫草素可抑制多類型腫瘤細胞的增殖、轉移并促進癌細胞凋亡[8-10]。凋亡是最常見的程序性細胞死亡形式,但癌細胞常見細胞凋亡抗性,因此抑制癌細胞惡性增殖并促進其凋亡常為癌癥治療的重要靶點。據報道,紫草素可通過多種生物學途徑和靶點抑制BC細胞遷移及侵襲等惡性進展,并可發揮順鉑耐藥抗性[11-12],本研究經不同濃度紫草素作用BC細胞后發現,其可呈濃度依賴性降低T24細胞存活率及集落形成數,并提高細胞凋亡率,提示紫草素可有效抑制BC細胞惡性增殖并促進凋亡,為BC治療的潛力藥物之一。

與正常細胞相比,由于遺傳不穩定性、慢性炎癥增加和代謝異常,許多類型的癌細胞傾向于提高氧化物質水平,氧化性物質反過來誘導基因突變和炎癥,導致更多氧化性物質產生,該循環最終導致持續的氧化應激反應,而在氧化應激中存活的癌細胞通過增強抗氧化能力來調動一系列適應性機制,這種適應性將有助于腫瘤細胞的惡性轉化、轉移及對ROS介導的腫瘤治療的抗性[13],因此,破壞腫瘤氧化還原穩態對癌癥治療至關重要。ROS主要在線粒體氧化代謝過程中產生,直接影響氧化還原穩態,其積累對細胞表現出雙重作用,一般來說,ROS上調會促進腫瘤發生,但越來越多的證據表明ROS過度積累可導致細胞凋亡[14]。過量產生ROS可導致細胞器功能障礙、氧化還原穩態紊亂,并通過ROS相關的線粒體途徑誘導細胞凋亡,大多數抗癌劑是通過增加ROS產生和消耗GSH水平來抑制癌細胞活力的[15-16]。Liang等[17]研究發現,紫草素可通過誘導癌細胞內ROS產生觸發線粒體介導的細胞凋亡;Tsai等[18]研究結果顯示,紫草素可通過升高不同類型腎癌細胞內的ROS水平減少腫瘤細胞增殖并引發程序性細胞死亡;另有研究表明,紫草素可通過激活ROS介導的內質網應激和線粒體凋亡途徑誘導人黑色素瘤細胞凋亡并抑制其增殖和腫瘤生長[19]。GSH是細胞內最豐富的氧化還原狀態調節劑,可保護細胞免受ROS生成介導的氧化損傷,其消耗可使細胞對凋亡刺激敏感或促進線粒體透化而使細胞易于死亡[20],MDA可反映質膜的氧化損傷程度。本研究結果顯示,紫草素可呈濃度依賴性提高T24細胞內的ROS及MDA水平,降低GSH含量,提示紫草素可能是通過介導BC細胞氧化還原穩態失衡進而抑制BC細胞惡性增殖并誘導凋亡。

Nrf2介導的抗氧化反應維持氧化還原穩態并在正常細胞中發揮抗炎和抗癌活性,但據報道,Nrf2在癌癥中被異常激活,增強的Nrf2表達可保護腫瘤細胞DNA免受ROS介導的損傷并促進癌細胞增殖、轉移、血管生成,同時提高化學和放射抗性,與預后不良相關[21]。生理條件下,Nrf2位于細胞質并依賴Keap1介導的蛋白酶體快速降解,組成性地維持在低蛋白水平;氧化損傷期間,Nrf2轉移至細胞核,與抗氧化反應元件結合并激活其下游靶基因,包括HO-1、NQO-1及參與GSH合成的酶等[22]。研究發現,通過增加Keap1表達,促進Nrf2泛素化降解,可抑制卵巢腫瘤生長[23];Nrf2沉默可抑制細胞增殖,提高細胞凋亡率,提高癌細胞內ROS水平[24],另有研究結果顯示,激活Nrf2依賴性抗氧化反應可保護BC細胞免受氧化應激損傷并促進BC生長[25]。本研究結果顯示,紫草素呈濃度依賴性提高Keap1 mRNA及蛋白表達,降低Nrf2 mRNA和蛋白及其下游抗氧化靶基因HO-1、NOQ1蛋白表達,提示紫草素可能通過抑制Keap1/Nrf2抗氧化通路激活,提高T24細胞氧化應激水平,促使癌細胞內氧化還原穩態失衡而達到細胞損傷作用,即促進癌細凋亡并抑制其惡性增殖。

綜上所述,紫草素可抑制BC細胞的惡性增殖并促進其凋亡,其作用機制可能與抑制Keap1/Nrf2抗氧化通路激活,降低抗氧化因子水平,促進癌細胞內ROS過度積累有關。