淫羊藿苷通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)人前列腺癌PC3細(xì)胞增殖和凋亡的影響

李 磊 武海波 邢偉只

前列腺癌是臨床常見(jiàn)男性泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤,多發(fā)于65歲以上中老年人群,可伴發(fā)骨髓壓抑癥、副腫瘤綜合征,并骨瘤轉(zhuǎn)移至全身各處,引發(fā)循環(huán)系統(tǒng)衰竭,危及患者生命安全[1]。近年來(lái),我國(guó)新增前列腺癌發(fā)病人數(shù)已居亞洲首位,且隨著老齡化社會(huì)的到來(lái)及膳食模式的改變,其發(fā)病率增高明顯[2]。臨床治療早期前列腺癌通常采用外科切除手術(shù)及根治性放療術(shù),治療效果良好,但對(duì)于晚期及轉(zhuǎn)移患者來(lái)說(shuō),僅能激素療法及化療,在激素抵抗、化療耐藥及高副作用的影響下,治療效果并不理想[3]。淫羊藿苷是從中藥淫羊藿中提取的中藥單體,具有抗炎、抗病毒、增加血流量、調(diào)節(jié)免疫、提升骨代謝等多種生物學(xué)效應(yīng)[4]。有研究表明[5],淫羊藿苷可通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤免疫抑制微環(huán)境,有效地觸發(fā)細(xì)胞凋亡并抑制乳腺癌細(xì)胞遷移,對(duì)女性泌尿生殖腫瘤表現(xiàn)出良好的抑制作用。然而,目前關(guān)于其對(duì)男性前列腺癌細(xì)胞的生物學(xué)影響及相應(yīng)機(jī)制研究尚少。本研究采用淫羊藿苷干預(yù)人前列腺癌PC3細(xì)胞,觀察其對(duì)該細(xì)胞增殖、凋亡的影響,并探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

人前列腺癌PC3細(xì)胞系,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物、主要試劑、儀器

淫羊藿苷(純度:98%,上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司),Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)通路激動(dòng)劑SB216763(上海百舜生物科技有限公司),細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)試劑盒[愛(ài)必信(上海)生物科技有限公司],兔抗人糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)、β-catenin一抗(英國(guó)Abcam公司)。

Synergy-HT酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司),FACSCanto流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

取PC3細(xì)胞系恒溫37 ℃解凍,置于培養(yǎng)箱內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)條件(37 ℃,5% CO2)下,經(jīng)RPMI-1640培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素及100 mg/L 鏈霉素)培養(yǎng),待細(xì)胞融合至貼壁,胰酶消化傳代,選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,取均值。

1.4 MTT法測(cè)定PC3細(xì)胞增殖活性

取對(duì)數(shù)期PC3細(xì)胞,胰酶消化重懸,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL接種至6孔板,待細(xì)胞融合至貼壁,每孔分別加入終濃度(6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L)淫羊藿苷DMSO溶液,48 h后加入新鮮制備MTT溶液20 μL,作用2 h吸棄上清,再加入DMSO 150 μL,振蕩15 min后靜置,酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處各孔吸光度值,計(jì)算各濃度細(xì)胞抑制率(%)=(1-各濃度孔吸光度值/對(duì)照細(xì)胞吸光度值)×100%,繪制折線圖得出半抑制濃度(median inhibition concentration,IC50)。

1.5 干預(yù)與分組[6]

取對(duì)數(shù)期PC3細(xì)胞,胰酶消化重懸,待其融合至貼壁,隨機(jī)分為對(duì)照組、淫羊藿苷組、激動(dòng)劑組、聯(lián)合組,對(duì)照組在RPMI-1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng),淫羊藿苷組培養(yǎng)基中加入淫羊藿苷DMSO溶液(終濃度100 μmol/L),激動(dòng)劑組培養(yǎng)基中加入SB216763 DMSO溶液(終濃度20 μmol/L),聯(lián)合組加入淫羊藿苷DMSO溶液(終濃度100 μmol/L)、SB216763 DMSO溶液(終濃度20 μmol/L)。各組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,干預(yù)48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 MTT法檢測(cè)各組增殖能力

取干預(yù)48 h后的各組細(xì)胞,胰酶消化重懸,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL接種至96孔板,加入RPMI-1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng),培養(yǎng)24、48、72 h 3個(gè)不同時(shí)刻分別加入新鮮制備MTT溶液20 μL,作用2 h吸棄上清,再加入DMSO 150 μL,振蕩15 min后靜置,酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處各組各時(shí)刻吸光度值。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組凋亡率

取干預(yù)48 h后的各組細(xì)胞,胰酶消化重懸,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL接種至6孔板,加入RPMI-1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)48 h,PBS洗滌,低溫離心8 min(3 000 r/min,r=10 cm),binding buffer液標(biāo)記細(xì)胞,加入AnnexinV-FITC 5 μL染色,再加入PI 5 μL二次染色,避光染色20 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,并計(jì)算各組凋亡率。

1.8 檢測(cè)細(xì)胞上清液VEGF水平

收集各組細(xì)胞上清液,經(jīng)ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液VEGF水平,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)步驟,酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處吸光度值,繪出曲線計(jì)算VEGF濃度。

1.9 免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞GSK-3β、β-catenin蛋白表達(dá)

取干預(yù)48 h后的各組細(xì)胞,PBS洗滌,RIPA液裂解細(xì)胞,移至離心管內(nèi),低溫離心15 min(10 000 r/min,r=12 cm),吸棄上清,經(jīng)BCA法定量蛋白。取40 μg待測(cè)樣本與4倍體積SDS-PAGE緩沖液混合,沸水浴加熱變性,離心取上清,行上樣電泳分離,濕轉(zhuǎn)至PVDF膜,BSA液封閉2 h,加入兔抗人GSK-3β、β-catenin一抗(1∶500),4 ℃冷藏過(guò)夜,TBST清洗,加入二抗(1∶2 000)常溫孵育2 h,TBST清洗,加入電化學(xué)發(fā)光試劑發(fā)光,暗室顯影,成像分析儀分析各條蛋白條帶灰度值,以GSK-3β、β-catenin蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值之比代表細(xì)胞GSK-3β、β-catenin相對(duì)蛋白表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各濃度淫羊藿苷對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率及IC50

經(jīng)終濃度(6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L)淫羊藿苷干預(yù)后,PC3細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高,IC50位于50～100 μmol/L之間,后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用100 μmol/L作為淫羊藿苷干預(yù)劑量。見(jiàn)圖1。

圖1 各濃度淫羊藿苷對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率

2.2 各組細(xì)胞增殖能力

與對(duì)照組比較,淫羊藿苷組24、48、72 h吸光度值降低(P<0.05),激動(dòng)劑組24、48、72 h吸光度值升高(P<0.05);與淫羊藿苷組比較,聯(lián)合組24、48、72 h吸光度值升高(P<0.05);與激動(dòng)劑組比較,聯(lián)合組24、48、72 h吸光度值降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞MTT吸光度值比較

2.3 各組細(xì)胞凋亡率

與對(duì)照組比較,淫羊藿苷組凋亡率升高,激動(dòng)劑組凋亡率降低(P<0.05);與淫羊藿苷組比較,聯(lián)合組凋亡率降低(P<0.05);與激動(dòng)劑組比較,聯(lián)合組凋亡率升高(P<0.05)。見(jiàn)表2,圖2。

表2 各組細(xì)胞凋亡率比較

圖2 細(xì)胞凋亡流式圖

2.4 各組細(xì)胞上清液VEGF水平

與對(duì)照組比較,淫羊藿苷組上清液VEGF水平降低,激動(dòng)劑組上清液VEGF水平升高(P<0.05);與淫羊藿苷組比較,聯(lián)合組上清液VEGF水平升高(P<0.05);與激動(dòng)劑組比較,聯(lián)合組上清液VEGF水平降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組各組細(xì)胞上清液VEGF水平比較

2.5 各組細(xì)胞GSK-3β、β-catenin蛋白表達(dá)

與對(duì)照組比較,淫羊藿苷組GSK-3β蛋白表達(dá)升高,β-catenin蛋白表達(dá)降低(P<0.05),激動(dòng)劑組GSK-3β蛋白表達(dá)降低,β-catenin蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。與淫羊藿苷組比較,聯(lián)合組GSK-3β蛋白表達(dá)降低,β-catenin蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與激動(dòng)劑組比較,聯(lián)合組GSK-3β蛋白表達(dá)升高,β-catenin蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見(jiàn)表4,圖3。

表4 各組細(xì)胞GSK-3β、β-catenin蛋白表達(dá)比較

圖3 各組細(xì)胞GSK-3β、β-catenin蛋白表達(dá)

3 討論

前列腺癌是起源自前列腺上皮細(xì)胞的一種生殖器官癌癥,早期無(wú)癥狀,逐漸表現(xiàn)為骨骼疼痛、進(jìn)行性貧血、腎功能衰竭、呼吸衰竭等重度并發(fā)癥[7]。該病發(fā)病隱匿、進(jìn)展緩慢,多數(shù)患者確診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移,失去根治機(jī)會(huì),高增殖性及低凋亡性是導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的主要原因[8]。因此,探尋抑制前列腺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的新藥物,是治療該病的關(guān)鍵。中醫(yī)將前列腺癌歸于“癥積”、“淋證”、“血尿”等癥范疇,治療應(yīng)以溫陽(yáng)補(bǔ)腎、祛濕解毒為主[9]。中藥淫羊藿是臨床常用補(bǔ)益中藥,可補(bǔ)助腎陽(yáng)而小便自利,溫通氣血、消化凝結(jié),通行經(jīng)絡(luò),祛除寒濕痹[10]。以淫羊藿為原料提取的中藥單體對(duì)前列腺癌的治療作用也逐漸受到關(guān)注。

VEGF是重要的腫瘤血管生長(zhǎng)促進(jìn)因子,在腫瘤自體生長(zhǎng)及間質(zhì)血管生成過(guò)程中發(fā)揮重要作用,其水平升高可增強(qiáng)瘤體新陳代謝、提升營(yíng)養(yǎng)供給,從而促進(jìn)癌細(xì)胞增殖,高水平VEGF亦會(huì)增加血管通透性,增強(qiáng)癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力[11]。淫羊藿苷是一種天然植物類黃酮,可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞非特異性殺傷作用及T細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的毒作用,從而提升細(xì)胞免疫功能,抑制腫瘤生長(zhǎng)[12]。Li等[13]研究認(rèn)為,淫羊藿苷可抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞活力及瘤體組織生長(zhǎng),增強(qiáng)體內(nèi)抗腫瘤體液免疫,促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡,提示淫羊藿苷或可成為實(shí)體腫瘤補(bǔ)充治療藥物。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,淫羊藿苷組24、48、72 h吸光度值降低,上清液VEGF水平降低,凋亡率升高,提示淫羊藿苷可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖及血管新生,促進(jìn)其凋亡。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是一條保守的癌基因通路,在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過(guò)程中扮演重要角色,其中GSK-3β、β-catenin是該通路重要組成蛋白[14]。β-catenin是一種細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白,在正常細(xì)胞內(nèi)可與E鈣粘蛋白結(jié)合,發(fā)揮細(xì)胞黏附作用,GSK-3β是Wnt信號(hào)通路調(diào)控酶,作為β-catenin拮抗蛋白起負(fù)向調(diào)控作用,在癌細(xì)胞內(nèi)Wnt信號(hào)增強(qiáng),其在細(xì)胞膜上與相應(yīng)跨膜蛋白結(jié)合,抑制GSK-3β活性,使β-catenin磷酸化降解減少,未降解β-catenin移至細(xì)胞核,促使Wnt/β-catenin通路異常激活,參與下游促癌靶基因轉(zhuǎn)錄,從而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[15]。Zou等[16]研究認(rèn)為,抑制Wnt/β-catenin通路活性可顯著抑制CRC細(xì)胞遷移及增殖,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,從而抑制結(jié)直腸癌裸鼠腫瘤生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,淫羊藿苷組GSK-3β蛋白表達(dá)升高,β-catenin蛋白表達(dá)降低,且在淫羊藿苷基礎(chǔ)上增用Wnt/β-catenin通路激動(dòng)劑SB216763可減弱淫羊藿苷對(duì)前列腺癌的治療作用,提示淫羊藿苷可能通過(guò)抑制該通路對(duì)前列腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡產(chǎn)生調(diào)控作用。

綜上所述,淫羊藿苷可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖及血管新生,促進(jìn)其凋亡,其作用機(jī)制可能與抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性有關(guān)。本研究仍然存在一定不足,例如前列腺癌細(xì)胞系有多種,本研究在實(shí)驗(yàn)條件的限制下僅選用一種細(xì)胞系,可能存在實(shí)驗(yàn)證據(jù)不足的問(wèn)題。此外,本文研究結(jié)果僅初步提示了淫羊藿苷可通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控人前列腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡,后續(xù)需進(jìn)一步驗(yàn)證。