靶向PD-1基因的miRNA210對膽囊癌細胞增殖、凋亡的影響

梁 靜 楊怡萍 王 冠 雷 磊 車 宇

原發(fā)性膽囊癌是肝外膽道常見的惡性腫瘤,發(fā)病率居消化道腫瘤的第6位[1-2],早期無特異性癥狀,就診時大多已至中晚期,放化療效果欠佳[3],文獻報道膽囊癌根治術(shù)后5年生存率不足5%[4]。現(xiàn)已證實免疫逃逸、表觀遺傳、microRNA等多種因素參與膽囊黏膜從單純增生到原位癌的發(fā)生發(fā)展過程[5-6],在PD-1/PD-L1信號通路通過抑制CD4+T細胞、CD8+T細胞的增殖與活化使腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸[7]。目前國內(nèi)外關(guān)于靶向PD-1基因的microRNA對膽囊癌細胞生物學特性的文獻較少。本文通過microRNA芯片篩選靶向PD-1基因的microRNA,分析其對膽囊癌 GBC-SD細胞的生物學行為的影響,為膽囊癌的免疫治療提高理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人膽囊癌GBC-SD細胞購自中科院上海細胞庫;DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司);胎牛血清(美國 Gibco 公司);RT-PCR試劑盒(Fermentas公司);Trizol、LipofectamineTM2000 (Takara公司);雙熒光報告基因檢測試劑盒(美國Promega公司);PD-1抗體(美國Invitrogen公司);PD-1過表達PCDNA3.1載體、引物設(shè)計由大連寶生物工程有限公司設(shè)計、合成;Agilent Human miRNA Microarray,Release 21.0(上海數(shù)譜生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 GBC-SD細胞培養(yǎng)及PD-1轉(zhuǎn)染 膽囊癌GBC-SD細胞在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育,取對數(shù)生長期GBC-SD細胞制備單細胞懸液,置于電擊杯內(nèi),加入15 μg PD-1過表達PCDNA3.1載體,行電穿孔轉(zhuǎn)染,另取2組細胞做陰性對照、空白對照,3組細胞放入培養(yǎng)箱中孵育48 h后進行后續(xù)實驗。

1.2.2 PD-1轉(zhuǎn)染后細胞增殖、凋亡的變化 取上述3組細胞,TRIzol法提取各組細胞總RNA,以PD-1引物為模板(上游引物:5'-ATGCTTAGCCTAGAACCGG-3',下游引物:5'TTCCGAAGTCGAGGCCAAG-3'),β-actin為內(nèi)參,92 ℃預(yù)變性 5 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸30 s,共40個循環(huán)。取3組對數(shù)生長期GBC-SD細胞,0.25%胰酶消化,1×104個/孔濃度接種于96孔板,培養(yǎng)箱中孵育24、48、72 h,加入10 μL CCK8溶液,孵育2 h,酶標儀測定吸光度 (A)值,每實驗組設(shè)3個復(fù)孔。收集各組轉(zhuǎn)染細胞,4 ℃ PBS 洗滌重懸,加入Annexin V-FITC 5 μL、PI 4 μL,37 ℃避光孵育30 min,流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.3 靶向PD-1基因的microRNA篩選及驗證 取PD-1轉(zhuǎn)染后GBC-SD細胞,TRIzol法提取各組細胞總RNA,依據(jù)miRNA Microarray說明書制備poly(A) Tailing Mix,將100 μL總RNA注入miRNA芯片進行雜交、清洗染色,SAM&R軟件分析芯片數(shù)據(jù),Cluster3.0軟件行聚類分析,選取表達差異最顯著的microRNA,Real Time法加以驗證。

1.2.4 熒光素酶報告基因驗證PD-1是miRNA210的靶基因 通過TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測miRNA210通過3'-UTR與PD-1結(jié)合,取對數(shù)生長期GBC-SD細胞,常規(guī)胰酶消化后,按照雙熒光報告基因檢測試劑盒說明將PD-1過表達PCDNA3.1載體轉(zhuǎn)染GBC-SD細胞,通過LipofectamineTM2000將miRNA210-mimic轉(zhuǎn)染至GBC-SD細胞,另取2組細胞做陰性對照、空白對照,采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組雙熒光素酶活性。

1.2.5 miRNA210轉(zhuǎn)染后細胞增殖、凋亡的變化 取對數(shù)生長期GBC-SD細胞,常規(guī)胰酶消化后,通過LipofectamineTM2000將miRNA210-mimic轉(zhuǎn)染至GBC-SD細胞,另取2組細胞做陰性對照、空白對照,取上述3組細胞,TRIzol法提取各組細胞總RNA,RT-PCR法檢測miRNA210 mRNA和PD-1 mRNA的相對表達;收集各組轉(zhuǎn)染細胞,4 ℃ PBS 洗滌重懸,加入Annexin V-FITC 5 μL、PI 4 μL,37 ℃避光孵育 30 min,流式細胞儀檢測細胞凋亡變化;CCK8法檢測細胞增殖變化。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù),計量資料用均數(shù)±標準差表示,2組以上數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-1轉(zhuǎn)染后細胞增殖、凋亡的變化

PD-1轉(zhuǎn)染后,GBC-SD細胞內(nèi)PD-1 mRNA表達水平明顯升高,表明PD-1已成功轉(zhuǎn)染至GBC-SD細胞。CCK-8法檢測結(jié)果繪制的生長曲線顯示,PD-1轉(zhuǎn)染組細胞增殖率高于陰性對照、空白對照組。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示,PD-1轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率明顯低于對照組(圖1),差異有統(tǒng)計學意義(F=25.90,P<0.0001)。

A:PD-1 mRNA表達水平;B:CCK檢測細胞增殖;C:流式細胞儀檢測細胞凋亡;D:細胞凋亡變化。

2.2 靶向PD-1基因的microRNA篩選及驗證

PD-1轉(zhuǎn)染GBC-SD細胞后,miRNA Microarray分析結(jié)果顯示人GBC-SD細胞 miRNA表達譜明顯發(fā)生改變,共54個miRNAs差異表達(相差2倍以上),其中上調(diào)miRNAs 30個,下調(diào)miRNA 24個(圖2),其中miRNA210表達差異最顯著。進一步運用RT-qPCR檢測加以驗證,結(jié)果顯示miRNA210在轉(zhuǎn)染組細胞內(nèi)相對表達量為(0.12±0.03),明顯低于陰性對照(2.35±0.48)、空白對照組(2.62±0.53),差異有統(tǒng)計學意義(F=25.90,P<0.,001),與microRNA芯片結(jié)果一致。

圖2 PD-1轉(zhuǎn)染后GBC-SD細胞內(nèi)miRNAs差異表達

miRNA210轉(zhuǎn)染后,miRNA210 mRNA表達水平達(12.5±3.8),高于陰性對照、空白對照組(F=33.56,P<0.0001),表明 miRNA210已成功轉(zhuǎn)染至GBC-SD細胞內(nèi);PD-1 mRNA相對表達量為(0.26±0.04),低于陰性對照(2.18±0.37)、空白對照組(2.44±0.41)(F=69.36,P<0.0001),表明 miRNA210可降低GBC-SD細胞內(nèi)PD-1的表達。熒光素酶報告基因結(jié)果顯示,miRNA210共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性 (0.57±0.14),低于陰性對照、空白對照組,差異有統(tǒng)計學意義(F=43.51,P<0.0001),表明miRNA210可通過與PD-1 3'-UTR結(jié)合,降低PD-1 mRNA表達。

2.3 miRNA210轉(zhuǎn)染后細胞增殖、凋亡的變化

通過LipofectamineTM2000使GBC-SD細胞內(nèi)過表達miRNA210,轉(zhuǎn)染后48 h,細胞增殖活性為(0.15±0.17),低于陰性對照(0.88±0.31)、空白對照組(0.85±0.29),有統(tǒng)計學差異(F=4.134,P=0.0431)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示,miRNA210轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率明顯高于陰性對照、空白對照組(圖3),差異有統(tǒng)計學意義(F=47.83,P<0.0001)。

A:細胞增殖;B:細胞凋亡;C:流式細胞儀檢測細胞凋亡。

3 討論

膽囊癌是膽道系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,位居消化道腫瘤第6位,早期起病隱匿,90%的膽囊癌患者就診時已屬中晚期,喪失根治性手術(shù)切除機會,5年總體生存率不足5%,傳統(tǒng)放化療等治療手段療效不容樂觀,腫瘤免疫治療是新興的一種抗腫瘤治療,在多個實體腫瘤臨床應(yīng)用中嶄露頭角[8-10],負共刺激信號分子PD-1與配體PD-L1 結(jié)合后,引起PD-1胞質(zhì)內(nèi)N端具有免疫受體酪氨酸抑制基序磷酸化,使T細胞表面受體的CD-3s和ZAP7去磷酸化,進而下調(diào)PI3K/AKt/mTOR信號通路[11-13]。PD-1/PD-L1信號通路繁冗復(fù)雜,其誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸的機制仍有待于進一步研究,然而PD-1/PD-L1阻斷劑的臨床應(yīng)用正如火如荼開展[14-15],文獻報道PD-1/PD-L1抗體藥物Pembrolizumab單藥治療晚期膽道惡性腫瘤客觀緩解率達17%[16],PD-1/PD-L1免疫阻斷劑Nivolumab已被美國FDA批準用于治療消化系統(tǒng)多種惡性腫瘤。

哺乳動物的基因組不編碼蛋白質(zhì)的序列稱為非編碼RNA,miRNA 是一類長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子[17],通過與靶基因mRNA 3'-UTR結(jié)合,從而抑制蛋白質(zhì)的表達,然而作為表觀遺傳調(diào)控的重要成員,參與膽囊癌發(fā)生發(fā)展的miRNA不計其數(shù)。本研究通過構(gòu)建PCDNA3.1載體使人膽囊癌GBC-SD細胞內(nèi)多表達PD-L1,GBC-SD細胞的增殖活性明顯增強,細胞凋亡減少,表明膽囊癌內(nèi)過表達的PD-L1可能參與了膽囊癌的發(fā)生發(fā)展過程,然而其具體機制不甚清楚。通過基因芯片篩選PD-L1相關(guān)的miRNA,從而為膽囊癌的表觀遺傳學研究提供理論數(shù)據(jù),本研究發(fā)現(xiàn)miRNA210是GBC-SD細胞內(nèi)差異表達最顯著的miRNA,通過檢索TargetScan miRNA研究數(shù)據(jù)庫預(yù)測PD-L1有可能是miRNA210的靶基因,雙熒光報告基因檢測結(jié)果也證實了這一點,說明表觀遺傳調(diào)控與腫瘤免疫相互作用共同參與膽囊黏膜從增生到癌變的惡性轉(zhuǎn)化過程。

免疫檢測點(check point)PD-1 結(jié)合配體 PD-L1誘導(dǎo)免疫耐受的信號通路研究較多[18],而且PD-1/PD-L1 抑制劑Nivolumab和Pembrolizumab的臨床效果較好,但對部分膽囊癌患者療效不甚理想,表明單一腫瘤免疫逃逸機制無法解釋部分膽囊癌患者PD-1/PD-L1 抑制劑的作用效果有限的原因。miRNA210在腎癌、腦膠質(zhì)瘤等腫瘤中起抑癌基因作用[19-20],本研究通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染使人膽囊癌GBC-SD細胞內(nèi)多表達miRNA210后發(fā)現(xiàn)GBC-SD細胞的增殖活性變?nèi)?細胞凋亡增加,進一步表明miRNA210通過與PD-L1 mRNA 3'-UTR結(jié)合后抑制細胞增殖,促進細胞凋亡,然而其在組織器官水平層面的作用機制仍有待于進一步研究。雖然有文獻報道PD-L1在膽囊癌組織中的陽性表達率高達34.14%,顯著高于癌旁組織,且其表達程度與血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移等因素相關(guān)[21],但對具體機制未加闡述。

膽囊癌的發(fā)生與基因突變、miRNA、免疫逃逸等多種因素相關(guān)。PD-L1具有促進人膽囊癌GBC-SD細胞增殖作用,可能參與膽囊癌發(fā)生過程,miRNA210通過與PD-L1 mRNA 3'-UTR結(jié)合抑制PD-L1表達,進而抑制GBC-SD細胞增殖,因此,miRNA210和PD-L1有望成為膽囊癌研究的新方向,然而其具體機制仍有待進一步探索。