楊志金,徐 江,徐雁華,陳 康,謝美明,唐康來

1.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二〇醫院康復醫學科,昆明 650032; 2.中國人民解放軍西部戰區總醫院骨科,成都 610083; 3.陸軍軍醫大學第一附屬醫院運動醫學中心,重慶 400038

肌腱損傷在體育運動及日常生活中均十分常見。肌腱損傷的治療是骨科及運動醫學的一個難題,目前仍沒有最佳治療方案,治療方法也尚有爭論,臨床迫切需要切實有效的治療方法[1- 2]。干細胞治療有望促進損傷肌腱組織再生,肌腱干細胞(tendon stem cells,TSCs) 是來源于肌腱組織的一種間充質干細胞[3-4]。TSCs具有多向分化潛能,并且在維持肌腱自我平衡及促進肌腱損傷修復中發揮關鍵作用。采用TSCs促進肌腱損傷修復是一項極有前景的治療方法。TSCs需要適當的支架以保持其干細胞的干性及成肌腱分化能力,且支架在肌腱組織再生的過程中起到重要作用[2]。

細胞外基質(extracellular matrix,ECM)及其組成成分對健康肌腱的發育及維護起到重要作用,肌腱組織ECM的主要成分是I型膠原[5]。I型膠原具有良好的生物相容性、生物活性及可降解性,是最適宜作為肌腱組織工程的生物材料[6]。水凝膠具有良好的生物相容性、天然的仿生特征,用作肌腱組織工程支架切實可行[7]。水凝膠為移植的TSCs提供了一個良好的載體及模擬ECM的微環境,營養物質及氧氣等能輕易地在水凝膠內部移動[8]。水凝膠在各類組織的損傷愈合過程中均有應用可能[9]。

筆者課題組在前期實驗中,按6∶1∶8的體積比,成功制作了殼聚糖/β-甘油磷酸鈉/膠原(chitosan/β-glycerophosphate/collagen,C/GP/Co)水凝膠,并對其理化性質及生物相容性進行了詳細研究。結果證實:C/GP/Co水凝膠對營養物質和水溶性代謝產物具有良好的滲透性,也有利于TSCs的存活及生長[10]。此外,C/GP/Co可在液體狀態時包裹細胞,通過微創的方式注射至損傷部位,然后在生理情況下,體溫37°C以上時形成凝膠。

本實驗擬首先建立大鼠急性跟腱損傷模型,然后將C/GP/Co水凝膠聯合TSCs注射至大鼠跟腱損傷區域,通過組織學、成肌腱相關基因的表達及成肌腱分化相關蛋白檢測等指標評價C/GP/Co聯合TSCs對大鼠跟腱損傷的治療效果,并分析其可能的作用機制。

材料與方法

1 實驗動物

98只雄性SD大鼠(4周齡,體重約100g,由陸軍軍醫大學實驗動物中心提供)。其中2只用于提取TSCs,96只用于進一步動物實驗。實驗動物均嚴格按照實驗動物治療和處理指南進行處理,實驗程序均由陸軍軍醫大學動物研究倫理委員會批準 [SYXK(渝)20170002]。

2 主要試劑

殼聚糖(脫乙酰度>95%,大連美侖生物公司,中國);β-甘油磷酸鈉 (上海瑞永生物公司,中國);Ⅰ型鼠尾膠原溶液(上海魯汶生物公司,中國);天狼星紅染色液(北京索萊寶公司,中國);苦味酸染色液(北京索萊寶公司,中國);mRNA提取試劑盒(Takara公司,日本);熒光定量PCR試劑盒(Takara公司,日本)。

3 主要儀器

E400POL偏振光顯微鏡(NIKON公司,日本);iMarkTM酶標儀(Bio-Rad 公司,美國);ABI 7500實時熒光定量PCR儀(Life Tech公司,美國);Cycler Real time PCR儀(BIO-RAD公司,美國);自動凝膠成像(Eppendorf公司,德國)。

4 方法

4.1SD大鼠跟腱TSCs的分離及培養 取4周齡雄性SD大鼠2只,體重約100g,用于SD大鼠跟腱TSCs的分離及培養,具體分離及培養步驟采用筆者課題組前期研究使用方法[10]。

4.2C/GP/Co水凝膠的配制 在超凈臺中、無菌條件下,配制體積比為6∶1∶8的C/GP/Co溶液,具體步驟采用筆者課題組前期研究使用方法[10]。

4.3大鼠跟腱損傷模型的建立及分組 取96只SD大鼠,建立左側后肢急性跟腱損傷動物模型,具體步驟采用筆者課題組前期研究使用方法,右側后肢不做任何處理[10]。

將96只左側跟腱缺損的SD大鼠完全隨機分為4個組,每組包含24只大鼠。分別為:(1)對照組:左側跟腱缺損術后,自然愈合組;(2)水凝膠組:單純在跟腱損傷區域注射300μL C/GP/Co水凝膠;(3)TSCs組:單純在跟腱損傷區域注射106TSCs;(4)TSCs聯合水凝膠治療組:在跟腱缺損區域注射300μL C/GP/Co水凝膠及106TSCs。

每組大鼠分別于損傷后2、4、6周,用CO2過度麻醉法各處死8只,迅速將大鼠左側跟腱完整取出,用于組織學檢測及基因、蛋白表達檢測。

4.4天狼星紅染色 分別將不同時間點的4組大鼠的跟腱取材。石蠟切片常規脫蠟、水化,蘇木素染色液染細胞核20min,自來水沖洗5min,蒸餾水沖洗1次,用天狼星紅苦味酸染色液染色1h,自來水沖洗5min,常規脫水、透明,中性樹膠封片。偏振光顯微鏡下觀察,采集圖像,圖像分析采用IPP(Image-Pro Plus)6.0專業圖像分析軟件,對Ⅰ型、Ⅲ型膠原的比例進行定量分析。

4.5實時熒光定量(real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)分析 為比較各組成肌腱基因的表達情況,采用PCR分析成肌腱Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及scleraxis(SCX)的變化情況。分別將不同時間點4組的大鼠跟腱取材,每個跟腱樣本取約200mg組織,分離提取總RNA,使用微量分光光度計測定RNA濃度,OD260/280范圍在1.7～2.1,符合要求,然后逆轉錄合成互補DNA(complementary DNA,cDNA),用ABI 7500 PCR儀進行PCR分析。所有的引物序列(表1)由primer 5.0軟件設計并由上海生工公司合成。每個樣本重復檢測3次,每個基因檢測3個PCR循環,檢測各基因擴增的Ct值,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為內參基因,目的基因的表達水平用2-△△Ct公式計算獲得。數據分析采用CFX Manager 3.0軟件(Bio-Rad),目標基因的表達水平標準化至內參基因水平。

4.6成肌腱分化相關蛋白檢測 肌腱相關的特定蛋白表達水平用蛋白質印跡法(western blot,WB)進行檢測,分別將不同時間點的4組大鼠跟腱取材,提取總蛋白,蛋白定量采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白質定量試劑盒完成(按照上海碧云天公司BCA試劑盒說明書操作)。用蛋白裂解液作為對照,用酶標儀562nm(540～590nm)測出樣本的吸光度值,分別計算各組標本的蛋白濃度。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳液中分離總蛋白,轉移蛋白到PVDF膜,室溫下用5%BSA封閉液(block buffer)封閉2h,分別加入對應的抗體Ⅰ型膠原(1∶500)、Ⅲ型膠原(1∶250)、SCX (1∶500)及GAPDH (1∶3000),4℃孵育過夜。再加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶3000),室溫孵育2h,用增強化學發光底物顯影印跡、曝光。蛋白的表達水平通過Image J軟件來測定條帶面積和灰度值,以GAPDH條帶為內參(n=3),計算4組的相對蛋白表達水平。

5 統計學分析

結 果

1 天狼星紅染色觀察

肌腱組織天狼星紅染色在偏振光顯微鏡下較容易區分出Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維,Ⅰ型膠原纖維較粗大、排列緊密,具有強雙折光性,呈紅色或橙色;而Ⅲ型膠原纖維較細,具有弱雙折光性,在鏡下呈綠色(圖1)。天狼星紅染色結果顯示損傷后2周時,各組的Ⅰ型膠原面積占比比較差異無統計學意義(P>0.05,圖1b)。在損傷后4周及6周時,TSCs聯合水凝膠治療組的Ⅰ型膠原面積占比明顯大于其他3組,差異有統計學意義(P<0.05,圖1b)。天狼星紅染色結果顯示損傷后2周時,各組的Ⅲ型膠原面積占比比較差異無統計學意義(P>0.05,圖1c)。在損傷后4周及6周時,TSCs聯合水凝膠治療組的Ⅲ型膠原面積占比明顯小于其他3組,差異有統計學意義(P<0.05,圖1c)。

圖1 天狼星紅染色觀察及Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原面積占比統計分析。a.損傷后2、4、6 周各組跟腱組織天狼星紅染色觀察,Ⅰ型膠原纖維呈橙黃色,Ⅲ型膠原纖維呈綠色,放大倍數:×100,標尺=200 μm;b.損傷后2、4、6周各組跟腱組織天狼星紅染色Ⅰ型膠原面積占比統計分析;c.損傷后2、4、6周各組跟腱組織天狼星紅染色Ⅲ型膠原面積占比統計分析。#:P<0.05;TSCs:肌腱干細胞

2 PCR檢測相關基因的表達

損傷后2、4、6 周時,各組Ⅰ型膠原及SCX mRNA的表達量均成逐漸上升趨勢,其中Ⅰ型膠原mRNA增加更明顯(圖2)。在損傷后2、4、6 周時,TSCs聯合水凝膠治療組Ⅰ型膠原及SCX mRNA的表達量均明顯高于其他3組,差異有明顯統計學意義(圖2a、c)。表明移植到大鼠體內的TSCs在C/GP/Co水凝膠的協同作用下,利于向肌腱細胞分化。

圖2 PCR檢測相關基因的表達。a.Ⅰ型膠原mRNA表達情況;b.Ⅲ型膠原mRNA表達情況;c.SCX mRNA表達情況。#:P<0.05;TSCs:肌腱干細胞

損傷后2周,各組Ⅲ型膠原mRNA的表達量開始增加,但各組之間無明顯差異。損傷后4周,各組Ⅲ型膠原mRNA的表達量增加至最高水平,但TSCs聯合水凝膠治療組明顯低于其他3組,差異有統計學意義(P<0.05)。損傷后6周,各組Ⅲ型膠原mRNA的表達量較前明顯降低,TSCs聯合水凝膠治療組明顯低于其他3組,差異有統計學意義(圖2b),表明移植到大鼠體內的TSCs在C/GP/Co水凝膠的協同作用下,可抑制損傷區域瘢痕組織的增生,有利于提高損傷肌腱愈合質量。

3 WB檢測相關蛋白的表達

損傷后2周,TSCs聯合水凝膠治療組Ⅰ型膠原明顯高于其他3組,差異有統計學意義(P<0.05)。但TSCs聯合水凝膠治療組Ⅲ型膠原明顯低于其他3組,差異有統計學意義(P<0.05)。各組之間SCX無明顯差異(圖3a、b)。

圖3 WB檢測相關蛋白的表達:檢測2周(a、b)、4周(c、d)及6周(e、f)各組成肌腱相關蛋白及細胞外基質蛋白(Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及SCX蛋白)的表達情況。各組以對照組數據為參照,評估各組間的表達量差異(n=3)。#:P<0.05;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶;TSCs:肌腱干細胞;protein relative fold change:蛋白質相對倍數差

損傷后4、6周,TSCs聯合水凝膠治療組的Ⅰ型膠原及SCX均明顯高于其他3組,差異有統計學意義(P<0.05)。TSCs聯合水凝膠治療組的Ⅲ型膠原明顯低于其他3組,差異有統計學意義(P<0.05,圖3c～f)。

討 論

肌腱是肌肉骨骼系統的重要組成部分,其作用是在肌肉和骨骼之間傳遞力量以實現關節運動[11]。肌腱損傷常在體育運動及其他劇烈活動中發生,是肌肉骨骼系統最常見的損傷之一,其病因是多因素的,包括創傷、長期過度使用、老齡、炎癥和遺傳因素[12]。由于肌腱的愈合能力差,損傷后不能有效修復,修復過程往往時間長,且常伴有瘢痕組織形成,導致損傷肌腱的機械性能下降,容易發生二次損傷或反復損傷[13]。肌腱損傷的治療通常采用非手術治療或手術治療,然而無論何種治療均有其局限性,不能恢復肌腱組織的天然成分、組織結構及機械性能[14-15]。

肌腱損傷臨床治療效果差,可導致持續不適、功能和活動能力受損,常伴有長時間的功能障礙。肌腱的血供較其他大部分結締組織差,肌腱再生及修復緩慢,而且效果不理想。肌腱損傷后往往不能恢復其正常的生理功能及生物力學狀態。肌腱損傷后,肌腱修復及瘢痕形成常同時發生。目前認為損傷肌腱的修復可以分為3個階段,包括:炎癥反應期、細胞增殖期、重塑與成熟期,這些階段互相重疊、相互依賴。在早期炎癥反應階期,紅細胞、炎癥細胞,特別是中性粒細胞浸潤至損傷部位,TSCs逐漸遷移至損傷部位,Ⅲ型膠原開始合成。損傷幾天后,在細胞增殖期,Ⅲ型膠原的合成達到最高峰;損傷幾周后,在重塑與成熟期,Ⅰ型膠原開始大量合成[16-17]。

干細胞是治療肌腱損傷、促進損傷肌腱修復極具前景的方法?，F有研究表明:間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)、骨髓間充質干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)、脂肪間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)等均能促進肌腱損傷修復[18- 19]。TSCs是肌腱來源,具有異體移植潛力的免疫豁免細胞[20]。使用TSCs治療肌腱損傷,促進肌腱損傷修復是最明智也是最有前景的治療策略。局部注射TSCs至大鼠跟腱損傷區域很難避免干細胞滲漏等問題,而且TSCs也很難長時間在損傷部位發揮治療作用,因此研究更適宜的干細胞移植技術顯得十分重要。使用生物支架材料包裹干細胞注射至損傷部位以治療肌腱損傷應是十分理想的策略,合適的生物支架材料應具有良好的生物相容性,不刺激宿主引起炎癥反應。

理想的肌腱組織工程支架應盡可能模擬肌腱的天然ECM,以調節營養物質、氧氣和代謝廢物,且免疫和炎癥反應較輕,同時應具有適當的機械性能、可降解性及良好的生物相容性,有利于細胞生長、增殖和分化[21]。水凝膠是一種具有生物活性、生物相容性及可生物降解的生物材料。現有研究表明:MSCs、BMSCs及ADSCs聯合殼聚糖及β-甘油磷酸鈉水凝膠,在體內及體外實驗中均取得了良好的效果[22- 23]。筆者在前期的實驗中制備并證實C/GP/Co水凝膠可充分模擬天然肌腱的ECM[10]。本研究證實C/GP/Co聯合TSCs可明顯促進I型膠原及SCX的表達。Ⅰ型膠原及SCX是肌腱在組織水平的特異標志[20]。與此同時,C/GP/Co聯合TSCs可降低大鼠跟腱損傷區域Ⅲ型膠原的表達。肌腱損傷早期,Ⅲ型膠原及肉芽組織在損傷區域大量增殖。在肌腱損傷的自然愈合過程中,成功塑形的典型特征是損傷區域的Ⅰ型膠原逐漸替代Ⅲ型膠原[24]。

SCX是TSCs分化的關鍵調節因素,是肌腱的特異標志物[25]。Ⅰ型膠原是肌腱里的主要膠原,占膠原總量的90%[16,26]。本實驗中Ⅰ型膠原和SCX的高表達表明損傷愈合的肌腱具有良好的膠原結構。Ⅰ型膠原和肌腱組織的機械強度密切相關,理想的Ⅰ/Ⅲ型膠原比例也與肌腱的愈合質量緊密相關[27]。本實驗通過建立大鼠跟腱缺損模型,使用C/GP/Co水凝膠聯合TSCs注射至損傷局部,結果證實C/GP/Co水凝膠聯合TSCs可明顯促進肌腱損傷愈合。具體表現為改善了細胞及膠原纖維的排列,增強了損傷愈合肌腱的生物力學性能等。本研究中,C/GP/Co水凝膠聯合TSCs組的Ⅰ/Ⅲ膠原比例較對照組等明顯升高,是其生物力學性能明顯增強的關鍵因素。

TSCs單獨治療肌腱損傷無明顯療效,本研究結論和其他學者的研究結果相一致。Chen等[28]研究證實:富血小板血漿可促進肌腱損傷愈合,TSCs可明顯增強PRP的治療效果,但單獨注射TSCs并不能促進肌腱損傷修復。其他證實干細胞有利于損傷肌腱修復的研究中,均使用了各種生物材料,包括肌腱凝膠[29]、纖維蛋白膠[30]及蠶絲膠原海綿狀支架[20]等。

本研究存在一些不足:首先本研究僅觀察了跟腱損傷后2、4、6 周的治療效果,研究周期較短,缺乏更長時間治療效果的研究資料;此外,本研究未進行C/GP/Co水凝膠聯合TSCs治療的作用機制研究。在下一步實驗中,筆者團隊將在C/GP/Co水凝膠的性能優化,及C/GP/Co水凝膠聯合TSCs治療肌腱損傷的作用機制等方面進行深入研究,為肌腱損傷的治療提供更堅實的理論基礎,以及為C/GP/Co水凝膠聯合TSCs治療肌腱損傷提供切實可行的策略。

作者貢獻聲明：楊志金:課題及實驗設計、操作、記錄,論文撰寫、修改及審校; 徐江、徐雁華、陳康:文獻檢索、資料收集整理、數據整理; 謝美明:實驗指導、論文修改及審校;唐康來:研究及課題指導、實驗指導、論文修改