熱性驚厥患兒外周血NOD樣受體蛋白3炎癥小體表達(dá)水平及臨床意義

楊麗麗,李斌,倪海東

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院兒科,江蘇 南通 226001)

熱性驚厥(febrile seizures,FS)是兒科常見的一種危重癥,臨床特征以突發(fā)全身強(qiáng)直性、陣攣性抽搐為主[1]。熱性驚厥預(yù)后一般良好,但不及時(shí)救治,持續(xù)的驚厥發(fā)作可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的功能障礙,引起癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥,導(dǎo)致預(yù)后不良[2]。因此,FS的早期評(píng)估和及時(shí)防治尤為重要。目前,FS的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明,常認(rèn)為與兒童神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育不完全、神經(jīng)元異常放電有著緊密關(guān)聯(lián)[3]。研究[4]表明,炎癥反應(yīng)參與了FC的發(fā)病機(jī)制,炎癥細(xì)胞因子表達(dá)增高會(huì)促進(jìn)神經(jīng)損傷,增加FC向癲癇的進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)。NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎癥小體是目前研究較為深入的炎癥小體,是由受體蛋白NLRP3、銜接蛋白ASC及Caspase-1蛋白所組成的寡聚體復(fù)合物,其能夠誘導(dǎo)白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、IL-6等促進(jìn)炎癥因子的表達(dá),激活炎癥反應(yīng),參與了多種疾病炎癥損傷的病理過程[5]。研究[6]發(fā)現(xiàn),NLRP3炎癥小體在FS炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮了重要作用。但目前關(guān)于NLRP3炎癥小體對(duì)FS患兒診治的臨床意義研究尚缺乏。為此,本研究通過檢測(cè)FS患兒血清NLRP3炎癥小體水平,分析其與FS發(fā)病的關(guān)系,并探討其預(yù)后判斷意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年5月至2021年11月于南通大學(xué)附屬醫(yī)院收治的90例FS兒童作為研究對(duì)象(FS組),其中男性58例,女性32例,年齡(2.14±1.09)歲,52例單純性熱性驚厥患兒(SPS組);38例復(fù)雜性熱性驚厥患兒(CFS組)。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合指南中關(guān)于FS診斷標(biāo)準(zhǔn)[7];(2)首次發(fā)病,于發(fā)病24 h內(nèi)入院就診;(3)年齡6個(gè)月～5歲;(4)既往無癲癇發(fā)作史。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)有原發(fā)性的顱腦損傷患兒;(2)有顱內(nèi)感染的患兒;(3)確診癲癇的患兒;(4)合并維生素D缺乏低鈣性抽搐癥者;(5)其他電解質(zhì)紊亂引起的抽搐;(6)合并代謝性疾病引起的抽搐。另選取同期因上呼吸道感染導(dǎo)致發(fā)熱的25例患兒作為發(fā)熱對(duì)照組(性別、年齡與FS組相匹配),其中男性17例,女性8例,年齡(2.49±1.15)歲,均排除驚厥、既往FS史、神經(jīng)系統(tǒng)疾病史者。選取同期25名健康兒童體檢者作為健康對(duì)照組(性別、年齡與FS組相匹配),其中男性16例,女性9例,年齡(2.35±1.11)歲,均排除既往FS史、神經(jīng)系統(tǒng)疾病史者。FS組、發(fā)熱對(duì)照組及健康對(duì)照組性別、年齡等一般資料對(duì)比,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審查,且與所有受試對(duì)象監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 FS組和發(fā)熱對(duì)照組均于患兒入院24 h抽取外周靜脈血8 mL,分為兩管,一份為非抗凝血,2 500 r/min離心15 min收集血清;另一份則為EDTA抗凝血;置于-80 ℃下保存待測(cè)。健康對(duì)照組于體檢時(shí)收集外周血,同法保存。

1.2.2 血清NLRP3炎癥小體的測(cè)定 總RNA抽提取:外周靜脈血2.5 mL,置于抗凝管,用人淋巴細(xì)胞分離液無菌分離外周血單核細(xì)胞,并加入TRIzol提取試劑100 μL,三氯甲烷200 μL混勻靜置3 min,于4 ℃ 13 000 g離心8 min取上清液加入0.8 mL異丙醇混勻-20 ℃放置15 min后4℃ 13 000 g離心10 min,吸除上清液加入75%乙醇0.75 mL,洗滌沉淀,再次4 ℃ 13 000 g離心5 min,去上清液加無RNA酶的水20 μL,55 ℃條件下孵育5 min取PCR管加入含2 μg RNA的溶液,加1 μL胸腺嘧啶組成的核苷酸鏈,再加無RNA酶的去離子水至12 μL于PCR儀上放置70 ℃ 5 min,迅速放入冰上冷卻,加入5×緩沖液4 μL dNTPs 10 mmol/L 2 μL,RNA抑制劑1 μL和反轉(zhuǎn)錄酶1 μL,移液器抽吸混勻PCR儀上42 ℃保持60 min后繼續(xù)80 ℃滅活5 min,PCR擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性10 min,循環(huán)條件95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,共計(jì)40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增結(jié)果采用Ct法PCR引物設(shè)計(jì)由上海生工生物工程股份有限公司合成用于基因檢測(cè)。使用2-△△Ct法對(duì)外周血NLRP3、接頭蛋白凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase-1)的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行計(jì)算。

1.2.3 IL-1β、IL-6等其他生化指標(biāo)的測(cè)定 取血清標(biāo)本,使用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和神經(jīng)烯醇化酶(NSE)的測(cè)定。

1.2.4 預(yù)后隨訪及分組 FS患兒均根據(jù)病情,予以降溫、抗生素等對(duì)癥治療。出院后,對(duì)患兒隨訪至出院后6個(gè)月,根據(jù)患兒是否遺留神經(jīng)發(fā)育后遺癥包括智力、運(yùn)動(dòng)、語言、癲癇等,將患兒分為預(yù)后良好組(n=68)與預(yù)后不良組(n=22)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 FS組、發(fā)熱對(duì)照組及健康對(duì)照組血清NLRP3炎癥小體及炎癥指標(biāo)比較

3組患兒血清NLRP3炎癥小體mRNA表達(dá)水平及血清IL-1β、IL-6、TNF-α和NSE水平比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與發(fā)熱對(duì)照組和健康對(duì)照組相比,FS組血清NLRP3炎癥小體mRNA表達(dá)水平增高(P<0.05),且血清IL-1β、IL-6、TNF-α和NSE水平也顯著增高(P<0.05)。見表1。

表1 FS組、發(fā)熱對(duì)照組及健康對(duì)照組血清NLRP3炎癥小體及炎癥指標(biāo)比較

2.2 不同分型FS患兒血清NLRP3炎癥小體及炎癥指標(biāo)比較

不同分型FS患兒血清NLRP3炎癥小體及炎癥指標(biāo)比較,CFS組血清NLRP3炎癥小體mRNA表達(dá)水平及IL-1β、IL-6、TNF-α和NSE水平均高于SPS組(P<0.05)。見表2。

表2 SPS組與CFS組血清NLRP3炎癥小體及炎癥指標(biāo)比較

2.3 不同預(yù)后患兒血清NLRP3炎癥小體及炎癥指標(biāo)比較

不同預(yù)后患兒血清NLRP3炎癥小體及炎癥指標(biāo)比較,預(yù)后不良組血清NLRP3炎癥小體mRNA表達(dá)水平及IL-1β、IL-6和NSE水平均高于預(yù)后良好組(P<0.05)。見表3。

表3 不同預(yù)后患兒血清NLRP3炎癥小體及炎癥指標(biāo)比較

2.4 血清NLRP3水平與臨床資料的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析顯示,FS患兒血清NLRP3水平與IL-1β(r=0.351)、IL-6(r=0.339)、TNF-α(r=0.342)和NSE(r=0.308)水平均呈正相關(guān)(P<0.05)。

2.5 血清NLRP3水平對(duì)FS的診斷效能

ROC曲線分析顯示,血清NLRP3水平診斷FS的AUC為0.724(95%CI:0.617～0.814),截?cái)嘀等?.4時(shí),其敏感度為55.6%,特異度為86.9%。見圖1。

2.6 血清NLRP3水平對(duì)FS患兒預(yù)后不良的預(yù)測(cè)效能

ROC曲線分析顯示,血清NLRP3水平預(yù)測(cè)FS患兒預(yù)后的AUC為0.715(95%CI:0.611～0.809),截?cái)嘀等?.3時(shí),其敏感度為51.9%,特異度為78.7%。見圖2。

3 討論

FS是一種由高熱所誘發(fā)的驚厥,因突發(fā)性神經(jīng)元異常放電而導(dǎo)致抽搐癥狀,多見于6個(gè)月～5歲兒童。驚厥的反復(fù)發(fā)作可造成腦神經(jīng)損傷,引起癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥,導(dǎo)致預(yù)后不良。FS的發(fā)病機(jī)制至今未完全明確。發(fā)熱是引起驚厥的重要誘因,而發(fā)熱的本質(zhì)在于炎癥反應(yīng),與高熱相關(guān)的促炎因子如IL-1β、IL-6等表達(dá)增高,是FS發(fā)生、持續(xù)的關(guān)鍵因素[8]。研究[9]證實(shí),增高的體溫引起IL-1β、IL-6等炎癥遞質(zhì)表達(dá)上調(diào),介導(dǎo)炎癥反應(yīng),影響神經(jīng)元傳導(dǎo),從而參與FS的發(fā)生并使其加劇。但目前針對(duì)促炎因子與熱驚厥發(fā)生機(jī)制的相關(guān)研究[10]中,檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)均是在熱驚厥發(fā)生之后,因此這些促炎因子可能不是導(dǎo)致FS發(fā)生的關(guān)鍵因素,且有研究[11]發(fā)現(xiàn)熱驚厥發(fā)生之后產(chǎn)生的促炎因子可能與熱驚厥后的成年癲癇發(fā)生更為相關(guān)。因此,推測(cè)FS發(fā)生前改變的炎性體可能對(duì)高熱引起的驚厥發(fā)作可能有著更為重要的作用。

NLRP3炎癥小體是備受關(guān)注的炎癥小體,其可通過識(shí)別危險(xiǎn)相關(guān)分子模式來激活炎癥反應(yīng),是啟動(dòng)先天性免疫反應(yīng)的重要手段。NLRP3炎癥小體是由NLRP3、ASC以及pro-Caspase-1組成的多聚體蛋白復(fù)合物。當(dāng)機(jī)體遭受外源病原體侵襲或接收到內(nèi)源危險(xiǎn)信號(hào)時(shí),ASC招募效應(yīng)蛋白pro-Caspase-1,炎癥小體自我裝配,并水解出具有活性的Caspase-1,進(jìn)一步剪切釋放IL-1β、IL-6等促炎因子成熟體,從而參與下游炎癥因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[12],由此可見 NLPR3炎性小體活化是IL-1β、IL-6等促炎因子成熟的關(guān)鍵。NLPR3炎癥小體作為天然免疫系統(tǒng)的重要組成,在機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)過程中有著重要作用。研究[13-14]發(fā)現(xiàn),NLPR3炎癥小體在川崎病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化癥等多種疾病中均被激活。還有研究[15]發(fā)現(xiàn),NLRP3炎癥小體活化參與了急性熱應(yīng)激所致的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng),熱應(yīng)激組小鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白水平與對(duì)照組相比升高。提示NLRP3-Caspase-1作為炎癥小體的關(guān)鍵組成部分,可能是受高熱刺激后最早啟動(dòng)的炎癥因子。大鼠癲癇模型中,NLRP3炎癥小體的表達(dá)水平上調(diào)[16]。且NLRP3炎癥小體作為炎癥反應(yīng)的“總開關(guān)”,參與了FS的發(fā)生發(fā)展[17]。本研究使用熒光定量PCR對(duì)FS患兒血清NLRP3炎癥小體表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),FS患兒外周血NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA表達(dá)水平相比對(duì)照組增高,且CFS組高于SPS組,這與Wang等[18]報(bào)道一致,表明NLRP3炎癥小體可能參與了FS的發(fā)生發(fā)展。研究[19]認(rèn)為,當(dāng)受到高熱刺激后,NLRP3會(huì)招募頭蛋白ASC,同時(shí)在ASC的銜接之下,促進(jìn)pro-Caspase-1發(fā)生水解,產(chǎn)生有活性的Caspase-1,進(jìn)一步剪切炎癥因子IL-1β的前體,形成成熟的IL-1β并分泌至胞外參與一系列炎癥反應(yīng),進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)釋放,使得神經(jīng)元過度興奮,從而導(dǎo)致FS發(fā)生。

為明確NLRP3如何促進(jìn)FS炎癥反應(yīng),本研究還對(duì)下游IL-1β、IL-6等促炎因子進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)FS患兒血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均呈高表達(dá),與既往報(bào)道[20]一致。IL-1β是重要的促炎因子,能夠誘導(dǎo)IL-6和TNF-α的表達(dá),這些因子均與FS的發(fā)生相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn),FS患兒外周血NLRP3 mRNA表達(dá)水平與IL-1β、IL-6和TNF-α水平均呈正相關(guān),這提示NLRP3的激活可能促進(jìn)IL-1β分泌,進(jìn)而參與FS的炎癥反應(yīng)及發(fā)生發(fā)展。IL-1β、IL-6和TNF-α均是反映炎癥反應(yīng)的常用指標(biāo),與FS的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。NSE作為一種腦損傷標(biāo)志物,也能夠反映FS患兒病情[21]。本研究發(fā)現(xiàn),FS患兒血清NSE高于對(duì)照組,且CFS組高于SPS組,這也提示NSE能夠反映FS的發(fā)生發(fā)展。

本研究還顯示,預(yù)后不良組外周血NLRP3表達(dá)水平高于預(yù)后良好組,這說明NLRP3表達(dá)與FS患兒預(yù)后相關(guān),能夠提示患兒腦損傷風(fēng)險(xiǎn)。使用ROC曲線評(píng)價(jià)NLRP3表達(dá)水平對(duì)FS診斷和預(yù)后判斷的價(jià)值。結(jié)果顯示,血清NLRP3水平診斷FS的AUC為0.724,預(yù)測(cè)預(yù)后的AUC為0.715,這表明血清NLRP3表達(dá)水平可用于FS的診斷,并具有預(yù)后判斷價(jià)值。

綜上,NLRP3炎癥小體可能參與了高熱相關(guān)炎癥反應(yīng),與FS的發(fā)病及病情相關(guān),監(jiān)測(cè)外周血NLRP3炎癥小體的表達(dá)對(duì)于FS的診治和預(yù)后判斷有重要意義。但本研究樣本量有限,關(guān)于NLRP3炎癥小體在FS發(fā)病及預(yù)后中的作用仍有待更多研究探討。