逍遙散加味顆粒對大鼠肝纖維化TGF-β1/Smad通路的影響

唐琦,賀俊,蔡林

(川北醫學院附屬醫院中醫科,四川 南充 637000)

肝纖維化實質上是肝臟損傷時的一種自我修復反應,當致病物質侵入肝臟細胞,肝細胞發生炎癥和壞死刺激,以膠原纖維為主的細胞外基質(ECM)彌漫性增生、沉積,進行自我修復,出現過度代償,最終逐漸發展為肝纖維化[1]。肝星狀細胞(HSCs)活化是肝纖維化的關鍵環節,活化的HSCS轉變為肌成纖維細胞,合成ECM,導致肝臟ECM生成和降解平衡被打破,最終發展為肝纖維化[2]。轉化生長因子-β1(TGF-β1)主要是通過與細胞膜上的受體結合,激活細胞內的Smad2、Smad3,活化HSCs,促進ECM沉積彌漫增生、沉積,最終發展為肝纖維化[3];因而TGF-β1能調節膠原代謝,是促進肝纖維化的關鍵細胞因子[4],而細胞內的Smad2、Smad3在TGF-β1/Smad通路中發揮著重要的介導作用[5];而抑制肝臟細胞內Smad2、Smad3的激活,抑制TGF-β1/Smad信號通路,則能一定程度上對肝臟纖維化的發生、發展具有延緩及改善效果[6]。研究[7]發現,可通過抑制TGF-1誘導的上皮間質轉化,阻斷TGF-1的自分泌來減輕其誘導的膠原合成,阻止肝纖維化的發生、發展。臨床研究[8]觀察表明,逍遙散加味顆粒能有效降低病人肝纖維化指標,改善肝功能,但其降低肝纖維化指標的作用機制缺乏動物實驗證據。本研究擬在前期臨床治療效果及研究的基礎上[9-10],用TGF-β/Smad信號通路作為治療肝纖維化研究的切入點,探討逍遙散加味顆粒治療肝纖維化大鼠的分子學機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

逍遙散加味顆粒:茯苓、柴胡、白芍、枳殼、白術、當歸、三棱、莪術、鱉甲、生地、枸杞、雞血藤、黨參、黃芪、甘草。以上藥物均購自川北醫學院附屬醫院中藥房。復方鱉甲軟肝片(內蒙古福瑞制藥有限責任公司),扶正化瘀膠囊(上海黃海制藥有限責任公司),四氯化碳(天津傲然精細化工研究所)。TRNzol Universal試劑(天根生化科技有限公司,目錄號:DP424);逆轉錄試劑盒(Takara,RR820A;RR037A);逆轉錄相關引物設計(擎科生物科技有限公司);兔抗鼠GAPDH(成都正能生物,380626);Collagen I(成都正能生物,250401);TGF-β1(成都正能生物,346599);ECL顯影液(成都正能生物,17046);酶聯免疫吸附測定試劑盒(上海茁彩生物:TGF-β1,C-37645)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型與分組 采用SPF級SD大鼠78只,雌雄各半,體重(180±20)g,來自川北醫學院動物實驗中心,正常喂養1周后,將其隨機分為正常組(n=12)和模型組(n=66)。正常組小鼠予以正常水和飼料喂養9周;造模組第1次給予皮下注射40% CCL4花生油溶液5 mL/kg,此后每周皮下注射3 mL/kg 2次;前2周用20%豬油、0.5%膽固醇以及79.5%玉米混合飼料喂養,后7周用0.5%膽固醇和99.5%玉米面混合飼料喂養;飲用水為10%乙醇溶液[11]。造模結束后,在模型組中隨機抽取3只大鼠進行肝組織活檢,其余大鼠采用超聲瞬時彈性成像技術探測,肝硬度測定值(LSM)>7.3 kPa[12]為造模成功。見圖1。

模型制備結束,將剩余造模組63只大鼠隨機分為對照組(n=12)、高劑量組(n=13)、低劑量組(n=13)、復方鱉甲組(n=13)及扶正化瘀組(n=12)。正常組與模型組不進行干預,其余組分別灌胃給予相應劑量的對應藥物,高級劑量組用逍遙散加味顆粒灌胃16 g·kg-1·d-1,低劑量組用逍遙散加味顆粒灌胃8 g·kg-1·d-1,復方鱉甲軟肝片灌胃0.5 g·kg-1·d-1,扶正化瘀膠囊灌胃0.5 g·kg-1·d-1,連續4周。末次給藥禁食8 h后,大鼠進行目內眥取血;禁食24 h后,予以1%戊巴比妥鈉50 mg/kg注射液腹腔麻醉固定,解剖并保存肝組織,進行實驗檢測分析相關指標的變化情況。

1.2.2 肝組織病理形態學檢查 肝組織4%甲醛固定,常規石蠟包埋、切片。采用蘇木精-伊紅(HE)染色法,分析肝臟病理變化。HE染色程度分期[13]:0期為無肝纖維化形成;1期為肝臟匯管區纖維性擴大,但無纖維間隔形成;2期為肝臟匯管區纖維性擴大,可見少量纖維間隔形成;3期為多數纖維間隔形成,但無硬化結節;4期為早期肝硬化。

1.2.3 肝組織 TGF-β1和Smad通路含量的測定 (1)肝組織RNA的提取:采用 TRNzol試劑提取總RNA,42 ℃逆轉錄儀器上反應15 min,合成第一鏈 cDNA。取第1鏈反轉錄產物 2 μL作為熒光定量模板,反應體系為20 μL。(2)TGF-β1和Smad2引物序列。見表1。(3)擴增產物定量分析:先在95 ℃的環境中預變性5 min,再在95 ℃環境中變性10 s,60 ℃環境中退火延伸30 s,循環40次。反應結束后,使用電腦軟件自動分析讀取Ct值,采用相對定量法分析,待測基因 mRNA相對表達量=2-△△Ct。

表1 引物序列

1.2.4 蛋白質免疫印跡(Western blot) 檢測肝組織中TGF-β1、Smad2表達。稱取100 mg肝組織,將其加入RIPA細胞裂解液,提取總蛋SDS-PAGE凝膠電泳,轉膜,一抗、二抗孵育,洗膜后進行 ECL發光化學發光,X光片曝光、定影,通過凝膠成像。系統掃描分析定影后條帶吸光度值。并采用GraphPad Prism5.0 軟件分析計算每個蛋白條帶灰度值與內參照 GAPDH的灰度值的比值,以蛋白相對表達量進行校對表示。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠病理結果比較

各組大鼠經過不同藥物治療后,采用HE染色法,分析肝臟病理結構。正常組肝小葉結構清晰完整,肝血竇結構正常,肝細胞索排列整齊,無肝纖維化的形成,無纖維組織增生。對照組肝臟組織明顯被破壞,肝小葉結構破壞,纖維間隔形成,假小葉形成;匯管區可見大量炎性細胞浸潤。逍遙散加味顆粒高劑量治療組肝臟組織肝血竇中可見紅細胞、單核細胞,可見少量炎細胞浸潤,肝細胞索排列較低劑量組及復方鱉甲組、扶正化瘀組的整齊,肝小葉完整,未見匯管區纖維化。逍遙散加味顆粒低劑量治療組肝臟組織中可見炎性細胞浸潤,匯管區可見少量纖維化;復方鱉甲組可見肝細胞水腫變性,肝索細胞排列不規整,匯管區肝纖維化明顯,部分纖維間隔形成;扶正化瘀組肝細胞脂肪樣改變,肝索細胞排列不規整,肝臟組織中可見炎性細胞浸潤,匯管區纖維化明顯。見圖2。

2.2 各組肝組織TGF-β1 mRNA水平比較

與正常組比較,對照組大鼠肝臟中TGF-β1的mRNA表達水平高于正常組(P<0.05);與對照組比較,各治療組大鼠肝臟中的TGF-β1的mRNA表達水平均更低(P<0.05);與扶正組比較,高劑量組、低劑量組及復方鱉甲組治療組大鼠肝臟中的TGF-β1的mRNA表達水平均更低(P<0.05)。見圖3。

2.3 各組肝組織TGF-β1、Smad2蛋白表達水平比較

與正常組比較,對照組大鼠肝臟中TGF-β1、Smad2的蛋白表達水平增加(P<0.05);與對照組比較,各治療組大鼠肝臟中TGF-β1、Smad2的蛋白表達水平均降低(P<0.05);與逍遙散加味高劑量組對比,逍遙散加味低劑量組、扶正化瘀組及復方鱉甲組大鼠肝臟中TGF-β1、Smad2的蛋白表達水平均更高(P<0.05)。見圖4-圖6。

3 結論

肝纖維化是慢性肝炎發展成為肝硬化、肝癌的關鍵環節[14-15],引起肝纖維化的病因多樣,在肝纖維化階段進行積極有效的治療,是逆轉肝纖維化病變,抑制肝纖維化轉變為肝硬化、肝癌的關鍵階段。《肝纖維化中西醫結合診療指南(2019年版)》[16]提出,對肝纖維化的治療策略主要是對因治療及抗纖維化。西醫治療主要為消除病因,抗病毒治療;同時聯合保護肝臟細胞,避免使用肝臟損害藥物;而抗肝纖維化治療,西醫暫無特效藥物,中醫藥在治療肝纖維化、逆轉肝纖維化發揮著不可替代的作用。

“肝纖維化”屬于西醫病名,中醫學無此稱謂。結合肝纖維化的臨床癥狀,如面黃、脅肋部疼痛不適、惡心嘔吐等臨床癥狀,與中醫學“黃疸”“脅痛”“痞滿”等病證密切相關。關于病因病機觀點眾多,如牛建昭等[17]認為應該依照“濕-熱-毒-郁-痰-瘀-虛”的軌跡來理解和闡釋肝纖維化的病因病機,有研究[18]認為肝纖維化的關鍵病因是自身正氣不足,濕熱疫毒入侵機體;關鍵病機在于肝郁、血瘀、脾虛、濕熱。田鋒亮等[19]也認為肝郁脾虛證貫穿了肝炎到肝纖維化的各個階段。

楊濟銘等[20]認為,肝為剛臟,主藏血,肝氣郁結,瘀阻經絡為肝纖維化的主要病機;同時肝臟主調節,調節一身之氣。因此,肝氣郁結不通,肝木乘土,致脾運化失司,中焦濕邪偏盛,濕邪困阻脾胃,運化失司,氣血生化乏源,精血不能濡養肝脈;因此脾虛濕盛,氣血虧虛為兼見病機。在治療時,多采用疏肝、柔肝、養肝、化瘀、消癥、健脾、滲濕等治療原則。選用源自《太平惠民和劑局方》的逍遙散,具有疏肝解郁,健脾養血,柔肝緩急功效;以此方作為研究逍遙散加味顆粒的基礎方,加三棱、莪術、鱉甲、生地、枸杞、雞血藤、黨參、黃芪等多位藥共同組成,方中以北柴胡為君藥,用于疏肝解郁、條達肝氣;當歸養血和血;白芍養血斂陰、柔肝緩急;白術、茯苓健脾祛濕,使脾胃運化有司;炙甘草補中益氣、緩肝之急。酸味藥白芍與甘味藥甘草同用,酸甘化陰,滋養肝陰;大棗補中益氣;肝為氣機出入的樞紐,脾為氣機升降的樞紐,配伍枳殼瀉脾氣雍滯,調節中焦,與柴胡升降相宜,能增強疏肝理氣之效[21]。肝藏血,主疏泄,肝纖維化為慢性病,肝氣不疏日久,氣機郁結嚴重,氣滯則血瘀,故宜配伍行氣破結力量更為強盛的三棱、莪術、鱉甲軟堅散結,活血化瘀;肝纖維化是由于各種肝臟疾病遷延誤治,導致肝脾腎三臟功能障礙,氣滯血瘀損傷肝絡而成,屬于慢性疾病,久病入絡,配伍具有補血活血功效的雞血藤、當歸,既能化瘀通絡,又能兼故肝藏血的生理特點;清代陳士鐸在《石室秘錄》中提到:“腎生肝也,腎之中有火存焉,腎水干枯,腎不能生肝木矣,火無水制,則腎火沸騰……水足而熄,腎不克木,而反生木矣……至于肝為木臟,木生于水,其源從癸。”[22]說明了肝腎同源,腎臟為肝臟的母臟,母臟升發舒展,離不開水的滋養,子虛則補其母,配伍滋補肝腎藥物生地、枸杞;“見肝之病,知肝傳脾,當先實脾”,肝木克土,肝臟病變時應先充實脾臟,防止疾病進一步轉變,故加用黨參、黃芪補益脾氣,“脾為氣血生化之源”,黨參、黃芪為補氣要藥,同時與白術、茯苓相配伍,燥濕健脾,增強健脾之效。諸藥合用,使肝郁得疏、血虛得養、肝絡得通,癥瘕得消。

本研究將大鼠作為動物模型探討逍遙散加味顆粒對治療肝纖維化的作用,研究[23]表明,扶正化瘀片與復方鱉甲軟肝片對于治療肝纖維化有一定的效果,并且能夠有效抑制TGF-β/Smad2信號通路,因此選用扶正化瘀組與復方鱉甲作為比較組,更好的探討逍遙散加味顆粒的作用。本研究在干預4周后,逍遙散高劑量組的大鼠肝臟組織病理切片較對照組和逍遙散低劑量組及扶正化瘀組、復方鱉甲組病理切片中,炎性細胞浸潤、肝纖維化病變更少。這一結果說明,逍遙散加味顆粒在治療肝纖維化優于復方鱉甲軟肝片及扶正化瘀膠囊,并與劑量有關。逍遙散加味顆粒高劑量組的大鼠肝臟組織中TGF-β、Smad2的表達水平低于對照組和逍遙散低劑量組及扶正化瘀組、復方鱉甲組。這一結果說明,逍遙散加味顆粒治療肝纖維化大鼠能夠降低肝組織中TGF-β1 及Smad2蛋白表達水平,效果優于復方鱉甲軟肝片及扶正化瘀膠囊,并與劑量有關。對照組肝纖維化大鼠肝臟組織中TGF-β1、Smad2因子的表達情況與肝臟組織病理圖片結合分析可見,TGF-β/Smad2信號通路在肝纖維化的過程中具有關鍵影響;高劑量組逍遙散加味顆粒干預組與低劑量逍遙加味顆粒組、復方鱉甲組、扶正化瘀組及對照組相對比,高劑量組肝臟組織中TGF-β1、Smad2因子表達降低,TGF-β/Smad2信號通路受到抑制程度更大,同時高劑量組大鼠肝臟組織病理切片較對照組及其他組大鼠肝臟組織病理切片明顯好轉,炎性細胞浸潤減少,纖維化細胞明顯減少。本研究表明,中醫藥對于肝纖維化的治療均有一定的療效,但高劑量逍遙散加味顆粒尤為明顯,最主要的機制可能是減少TGF-β1、Smad2在肝臟組織中的表達,通過抑制TGF-β1/Smad2信號通路,抑制HSC的活化,降低ECM積累與沉積,減少肌成纖維細胞的轉變,從而抑制肝纖維化形成,減緩肝纖維化進程。

綜上,逍遙散加味顆粒能夠改善大鼠肝纖維化,主要通過減少肝臟組織中TGF-β1、Smad2的表達,抑制TGF-β1/Smad2信號通路,抑制HSC的活化與增殖,減少ECM的沉積,實現對抗肝纖維化及肝纖維化的逆轉。