車葉草苷通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激促進胰腺癌細胞凋亡的機制研究

曹齡之,付國旭,陳飛,李素平,楊凡慧

(1．川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院核醫(yī)學科,四川 南充 637000;2.綿陽市第三人民醫(yī)院核醫(yī)學科,四川 綿陽 621000)

胰腺癌(pancreatic cancer,PC)是最常見的消化道惡性腫瘤之一,發(fā)病率居全球第14位,5年生存率<10%[1],是全世界亟待解決的健康難題之一。胰腺癌早期臨床癥狀不明顯,大部分患者在確診時已處于癌癥晚期,無法進行手術治療。目前,化療是治療晚期胰腺癌的主要方法之一,但長期的化療藥物使用具有耐藥性和不良反應,影響患者預后。因此,開發(fā)新型藥物是臨床上治療PC的主要趨勢。

白花蛇舌草是傳統(tǒng)的中草藥,具有廣譜抗癌作用,對PC具有良好的輔助治療效果,可顯著改善PC患者的存活率。同時,可通過激活或抑制炎癥信號通路,抑制原癌基因的表達,抑制細胞增殖等機制[2-5],對白血病、肺癌、肝癌、惡性黑色素瘤、卵巢癌、結直腸癌等不同類型的腫瘤細胞具有明顯的抑制作用[6]。車葉草苷(asperuloside,ASP)是從白花蛇舌草中分離得到的一種環(huán)烯醚萜苷,在抗病毒、抗瘧疾、抗腫瘤、抗肥胖、抗炎和免疫調(diào)節(jié)方面具有良好的藥理活性[7-9]。目前研究[10-14]發(fā)現(xiàn),觸發(fā)ERS是化療藥物誘導癌細胞凋亡的常見途徑之一。本研究將ASP作用于人胰腺癌PANC-1細胞,探索ASP對人胰腺癌PANC-1細胞的作用和可能機制。

1 材料與儀器

1.1 細胞與試劑

人胰腺癌PANC-1細胞株購自普諾賽生物(Procell)。ASP(上海源葉生物,質(zhì)量分數(shù)98%, Z30S9B71533),二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司,SHBL0852),PANC-1專用培養(yǎng)基(Procell公司,WHO1112104XP),胰酶(含EDTA)細胞消化液(上海源培生物科技有限公司,H120802),胰酶(EDTA)細胞消化液(安徽博美生物科技有限責任公司,BMB1127),胎牛血清(Gibco公司,1027-106),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抑制劑4-苯基丁酸鈉鹽(4-PBA)(上海麥克林生化科技有限公司,C11876079),CCK-8(Biosharp,70091000),結晶紫(Solarbio,822S044),乙醇(成都市科龍化工試劑廠,20210223),Matrigel基底膠(CORNING,97011),Annexin V-APC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(凱基生物科技有限公司,20210526),PBS緩沖液干粉(上海遠慕生物科技有限公司,201224A18)。

活化轉錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6)兔多克隆抗體(24169-1-AP),C/BEP環(huán)腺苷酸反應元件結合轉錄因子同源蛋白(C/EBP Homologus Protein,CHOP)兔多克隆抗體(15204-1-AP),蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase-like ER kinase,PERK)和磷酸化的PERK(p-PERK)兔多克隆抗體(A24390-1-AP,29546-1-AP)均購自proteintech公司; cleaved-caspase-3兔多克隆抗體(AF6311,AF7022)購自AFFinity公司;R1抑制核轉錄因子-κB抑制蛋白α(p-IRE1α)兔多克隆抗體(PA5-117222)購自賽默飛公司;β-actin兔單克隆抗體(AC026)購自abclonal,生物素化山羊抗兔IgG(H+L)(ab6721)購自abcam公司。

1.2 儀器與設備

DMI1倒置生物顯微鏡購自LEICA,TDZ4-WS型號臺式低速離心機購自長沙湘儀離心機儀器有限公司,MCO-15AC型二氧化碳培養(yǎng)箱購自三洋電機國際貿(mào)易有限公司,SW-CJ-2F潔凈工作臺購自蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司,SYQ-DSX-280B壓力蒸汽滅菌器購自上海宜川儀表廠,HH-1水浴鍋購自金壇市榮華儀器制造有限公司,UPH-‖-10T優(yōu)譜超純水制造系統(tǒng)購自成都超純科技有限公司,spectra max PLUS 384酶標儀購自Molecular Devices,cytoflex流式細胞分析儀購自Beckman,化學發(fā)光儀購自天能公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)與分組 PANC-1細胞復蘇后培養(yǎng)于含10%胎牛血清的PANC-1專用培養(yǎng)基中,并置于37 ℃、5% CO2和95% O2濕化環(huán)境中無菌培養(yǎng),密度約為80%～90%時,PBS洗滌,使用孵溫的胰酶消化,傳代。處于對數(shù)期的PANC-1細胞作為對照組,PANC-1細胞中加入ASP記為ASP組,PANC-1細胞中加入5 mmol/L 4-PBA記為4-PBA組,PANC-1細胞中加入4-PBA 和ASP記為ASP+4-PBA組。4-PBA組和ASP+4-PBA組在添加ASP前5 mmol/L 4-PBA預處理2 h。

1.3.2 CCK-8 法檢測各組細胞活力 取對數(shù)生長期的PANC-1細胞,PBS洗滌,胰蛋白酶消化后收集,250 G離心5 min,調(diào)節(jié)細胞密度為5×104個/mL,100 μL/孔接種于96孔板中(邊緣孔用無菌PBS填充),37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)。待貼壁后按加入含不同終濃度的ASP(1、2、3、4、5 mmol/L)新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。每組設4個復孔。同時設空白組(加入等量的培養(yǎng)液)和對照組,待藥物作用后吸去上清液,每孔加入已稀釋的CCK-8工作液110 μL,輕輕晃動培養(yǎng)板數(shù)次,37 ℃、5% CO2恒溫孵育2 h。采用酶標儀測定450 nm波長處各孔的吸光度,計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=[1-(實驗組OD-調(diào)零組OD)/(對照組OD-調(diào)零組OD)]×100%。并選取抑制率為50%時對應的ASP濃度作為后續(xù)處理濃度。

1.3.3 Transwell實驗檢測各組細胞遷移能力 將各組PANC-1細胞密度調(diào)節(jié)至5×105個/mL,在24孔板底部加入700 μL含15% FBS的完全培養(yǎng)基后,將Transwell小室放入板中。在Transwell小室中加入200 μL的細胞懸液,于孵箱中培養(yǎng)15 h。用鑷子小心取出小室,吸干上室液體,移到預先加入約800 μL預冷乙醇的孔中,室溫固定30 min后,吸干上下室固定液,加入適量0.1%結晶紫染液,室溫染色30 min。PBS沖洗浸泡數(shù)次,取出小室,吸去上室液體,用濕棉棒小心擦去上室底部膜表面上的細胞和染液,適當風干后鏡下拍照計數(shù)。

1.3.4 Annexin V-APC/PI 檢測各組細胞凋亡情況取對數(shù)生長期的PANC-1細胞,配制成單細胞懸液,調(diào)節(jié)細胞密度為2×105個/孔,2 mL/孔接種于6孔板中,37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)過夜。然后加入不同濃度藥物處理細胞后培養(yǎng)48 h。收集細胞,250 g離心5 min,棄上清,PBS重懸后獲得懸浮細胞。加入5 μL Annexin V- APC和5 μL PI輕輕混勻,室溫避光培養(yǎng)15 min。流式細胞儀進行檢測分析。

1.3.5 Western blot檢測各組細胞ATF6,CHOP,cleaved-caspase-3,PERK和p-IRE1α蛋白相對表達情況 收集各組細胞,冰PBS洗滌兩次后,在RIPA緩沖液中裂解,勻漿30 min,4 ℃下1 500 g離心5 min。采用BCA法檢測上清液中蛋白濃度。在12% SDS-PAGE中進行電泳,上樣量為30 μg。電泳結束后,將不同的目的片段轉至PVDF膜上,在用TBST緩沖液稀釋的5%脫脂奶粉中封閉 2 h。在PVDF膜中分別加入ATF6(1∶1 000)、CHOP(1∶1 000)、cleaved-caspase-3(1∶1 000)、PERK(1∶1 000)、p-IRE1α(1∶3 000)和β-actin(1∶100 000)一抗,4 ℃下孵育過夜。用TBST洗膜3次,每次5 min。將PVDF膜放入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000)中,搖床上輕搖,室溫孵育2～3 h。TBST沖洗3次,每次10 min。ECL顯影液顯色,凝膠成像儀上進行目的蛋白條帶光密度值計算。目的蛋白相對表達量=目的蛋白積分光密度值/內(nèi)參積分光密度值。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 ASP對PANC-1細胞增殖的影響

隨著ASP濃度的增加,PANC-1細胞增殖抑制率增加,ASP濃度與細胞的增殖抑制率正相關(P<0.01),說明ASP濃度越高,對PANC-1細胞的增殖抑制作用越強。見圖1。

2.2 ASP對PANC-1細胞遷移能力的影響

與對照組相比,ASP組的PANC-1細胞遷移數(shù)量明顯降低(P<0.05);4-PBA 組與對照組的細胞遷移數(shù)量無統(tǒng)計學差異;與ASP組相比,ASP+4-PBA組細胞遷移數(shù)量增多(P<0.05)。見圖2。

2.3 ASP對PANC-1細胞凋亡率的影響

與對照組相比,ASP組的細胞凋亡率明顯增加(P<0.05)。4-PBA組與對照組的細胞凋亡率無明顯差異;與ASP組相比,ASP+4-PBA組細胞凋亡率下降(P<0.05)。見圖3。

2.4 ASP對PANC-1細胞ERS相關蛋白表達情況的影響

檢測各組細胞ATF6,CHOP,cleaved-caspase-3,PERK和p-IRE1α蛋白表達情況。結果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,ASP組PANC-1細胞的ATF6,CHOP,cleaved-caspase-3,PERK和p-IRE1α蛋白相對表達量增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與ASP組相比, ASP+4-PBA組PANC-1細胞的ATF6,CHOP,cleaved-caspase-3,PERK和p-IRE1α蛋白相對表達下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

3 討論

PC是最具侵襲性的癌癥之一,由于其早期癥狀不明顯,確診時已處于晚期,錯過最佳手術時間。同時,由于化療產(chǎn)生的耐藥性,導致所有臨床分期患者的5年相對生存率僅為6%,預后極差[15]。自2000年以來,其發(fā)病率和死亡率分別以每年以1%和0.3%的速度緩慢上升[1]。因此,新型藥物的開發(fā),是改善PC患者預后的重要手段。

與傳統(tǒng)化療藥物相比,植物化學物質(zhì)產(chǎn)生的生物活性化合物常表現(xiàn)出強大的疾病治療特性,且具有較少的不良反應。研究[16]發(fā)現(xiàn),白花蛇舌草是PC患者中藥補充治療時最常用的一種單一草藥,可有效降低PC患者死亡率,其機制可能與抑制Sonic hedgehog信號通路從而抑制腫瘤血管生成有關;劉曉卉等[17]發(fā)現(xiàn),白花蛇舌草濃縮液可能通過PKM靶點顯著抑制胰腺癌細胞的糖酵解過程和增殖。 而ASP是白花蛇舌草的主要成分,并廣泛存在于杜仲科、茜草科如拉拉藤屬、巴戟天屬等植物中[18],因此本研究將ASP作用于人胰腺癌PANC-1細胞,探討ASP對于PANC-1細胞的作用。結果發(fā)現(xiàn),與對照組比較,ASP能夠抑制PANC-1細胞增殖,且ASP濃度與細胞的增殖抑制率呈正相關,ASP能夠降低細胞遷移能力和促使細胞凋亡,即ASP能夠從細胞增殖、遷移、凋亡三個方面降低PANC-1細胞活性。實驗還發(fā)現(xiàn)與對照組比較,ASP組的ERS蛋白ATF6,CHOP,cleaved-caspase-3,PERK和p-IRE1α表達明顯增加,說明ASP可能通過激活ERS發(fā)揮降低PANC-1細胞活性的作用。為了驗證這一結論的科學性,我們使用了ERS抑制劑4-PBA,設置了4-PBA組和4-PBA+ASP組,結果發(fā)現(xiàn),ERS被抑制后,ASP降低PANC-1細胞活性的作用是減弱的,進一步提示ASP可能通過激活ERS發(fā)揮抑制PANC-1細胞活性的作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成、折疊和修飾、脂質(zhì)合成和鈣儲存的重要細胞器[19]。當內(nèi)源性或外源性刺激導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的蛋白質(zhì)折疊功能障礙時,大量未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi),引起一系列后續(xù)反應,稱為ERS。如果ERS持續(xù),未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)不足以清除積累的未折疊和錯誤折疊的蛋白時,UPR信號通路將會驅(qū)動細胞凋亡[20]。García等[21]發(fā)現(xiàn),從活化的人中性粒細胞或死亡細胞釋放的中性粒細胞精氨酸酶-1可通過ERS途徑誘導癌細胞凋亡,在PC、乳腺癌、卵巢癌和肺癌細胞可表現(xiàn)出最高的敏感性。Shen等[22]對胰腺癌細胞的研究發(fā)現(xiàn),其分泌的外泌體可被T淋巴細胞吸收后激活p38 MAPK,誘導ERS從而介導T淋巴細胞凋亡,最終導致免疫抑制。本研究發(fā)現(xiàn),ASP能夠從細胞增殖、遷移、凋亡三個方面降低PANC-1細胞活性,還發(fā)現(xiàn)ASP組的ERS相關蛋白表達明顯增加,說明ASP可能通過激活ERS發(fā)揮降低PANC-1細胞活性的作用;而ERS被抑制后,ASP降低PANC-1細胞活性的作用是減弱的,進一步說明ASP降低PANC-1細胞活性的作用與ERS具有相關性。

UPR是可傳遞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中蛋白折疊狀態(tài)信息,從而增加蛋白質(zhì)折疊能力,降低未折疊蛋白負荷的信號途徑[23]。ATF6是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的關鍵傳感蛋白,可協(xié)調(diào)UPR,幫助細胞適應ERS[24]。研究[25-26]發(fā)現(xiàn),ATF6可介導UPR信號通路參與非甾體抗炎藥誘導的細胞凋亡,并通過促進炎癥參與慢性胰腺炎的進展。同時, ATF6上調(diào)可能是PC患者預后不良的有效指標[27]。PERK是ERS的主要轉導物和中樞調(diào)節(jié)因子,可通過與自身下游分子相互作用形成通路,參與調(diào)節(jié)細胞功能[28]。IRE1是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白,可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔應激敏感結構域監(jiān)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài),并通過細胞質(zhì)激酶結構域和RNase結構域觸發(fā)UPR[24]。PERK與IRE1均參與胰腺癌細胞的凋亡[29]。ERS可被ATF6通路,PERK通路和IRE1通路3個信號通路激活[30]。正常狀態(tài)下,ATF6、PERK和IRE1蛋白處于不活躍狀態(tài)。但當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應激時,PERK和IRE1通過自身磷酸化被激活,啟動UPR并調(diào)控下游轉錄因子,從而誘導細胞凋亡[31-32]。而CHOP是ERS下游最重要的促凋亡轉錄因子。當ERS誘導細胞凋亡時,CHOP的累積增加,從而控制其下游蛋白的表達來調(diào)節(jié)細胞死亡。本研究發(fā)現(xiàn),ASP處理后,PANC-1細胞ATF6,PERK,p-IRE1α和CHOP蛋白表達上調(diào),提示ASP可通過增加ERS相關蛋白ATF6,CHOP,PERK和p-IRE1α的表達,激活ERS,從而發(fā)揮降低PANC-1細胞活性的作用。

Caspase是一組以天冬氨酸為底物的半胱氨酸蛋白酶家族,在細胞凋亡過程中起關鍵作用,其家族高表達可誘發(fā)細胞凋亡的發(fā)生,caspase-3為其核心成員[33]。Caspase-3通常以無活性的caspase-3前體存在。研究表明,當細胞受到凋亡信號激活或外界有害物質(zhì)刺激時,caspase-3前體可轉變?yōu)橛谢钚缘腸aspase-3,即cleaved-caspase-3,從而參與細胞凋亡的發(fā)生[34]。本研究發(fā)現(xiàn),ASP組的cleaved-caspase-3表達是明顯上調(diào)的,說明ASP降低PANC-1細胞活性的作用可能也與cleaved-caspase-3相關,但cleaved-caspase-3與ERS是否具有關聯(lián)性目前還不明確,需要進一步的實驗研究。

綜上,ASP能夠從細胞增殖、遷移、凋亡三個方面降低PANC-1細胞活性,其機制可能與激活ERS有關。