梵凈山石斛開花特性及繁育系統(tǒng)研究

劉芳任啟飛胡世俊馬菁華陳云飛歐明燭李海波

(1.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南 昆明 650224；2.貴州省植物園，貴州 貴陽 550004；3.貴州梵凈山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局，貴州 銅仁 554400)

梵凈山石斛(Dendrobium fanjingshanense)為蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)附生草本植物，是2001年發(fā)現(xiàn)的1個(gè)新種[1]，其分布區(qū)域狹窄，在中國目前發(fā)現(xiàn)有分布的只有2個(gè)地方：貴州省梵凈山黑灣河，浙江省九龍山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)[2]。梵凈山石斛是瀕危植物，被列入現(xiàn)已被列為國家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物，其主要附生在喬木樹種上，分布高度為15～20m，其開花率高但結(jié)實(shí)率極低，是一種適應(yīng)性較強(qiáng)、喜濕、喜陰涼的植物[3，4]。梵凈山石斛具有藥用價(jià)值，可入藥用于治療口干、煩渴、熱病傷津、肺熱干咳、腰膝軟弱、陰傷目暗等病癥[5]；此外，其作為石斛蘭，其花黃褐色或橙黃色，具有極高的觀賞價(jià)值和育種價(jià)值。

目前，對(duì)梵凈山石斛的研究報(bào)道不多，主要集中在親緣關(guān)系、繁殖技術(shù)和營養(yǎng)成分等方面，研究表明，梵凈山石斛與細(xì)莖石斛親緣關(guān)系較近[6]。余水生等[7]進(jìn)行了梵凈山石斛種子無菌播種技術(shù)研究；楊天友等[8]測(cè)定了梵凈山石斛的營養(yǎng)成分，其含有豐富的營養(yǎng)成分，水浸出物含量最高，粗多糖含量次之，還含有粗纖維、蛋白質(zhì)、脂肪、總黃酮以及礦質(zhì)元素鉀、鈉、鈣、鎂、鐵、鋅等營養(yǎng)成分，除此之外，其還含有16種氨基酸和10種脂肪酸。梵凈山石斛與鐵皮石斛營養(yǎng)成分相比也具有一定優(yōu)勢(shì)，含有銅、鈣、鎂、鉀及硒5種礦質(zhì)元素，醇溶性浸出物，石斛堿的含量較高，但粗多糖的含量低[9]。

繁育特性是蘭科植物保育的基礎(chǔ)[10]，石斛蘭在自然情況下結(jié)實(shí)率低[11]，因此，在人工栽培條件下，研究其人工授粉技術(shù)，提高梵凈山石斛的結(jié)實(shí)率，對(duì)其繁殖和育種具有重要的意義。目前，對(duì)于梵凈山石斛沒有繁育生物學(xué)相關(guān)研究報(bào)道，本試驗(yàn)以梵凈山石斛為研究對(duì)象，開展其開花特性觀測(cè)以及人工授粉研究，并對(duì)蒴果的發(fā)育進(jìn)行了觀測(cè)，為其繁育研究提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為種植于貴州省植物園保育溫室內(nèi)的梵凈山石斛植株，栽培基質(zhì)為鹿沼土∶樹皮∶蛭石=2∶2∶1。選擇生長較好的植株進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花期各階段觀察及花部結(jié)構(gòu)測(cè)定

2023年2—4月，參考李偉倩[12]的方法，觀察花期各階段，直至花期結(jié)束。隨機(jī)抽取10朵梵凈山石斛盛開的花朵，放入保鮮袋中帶回實(shí)驗(yàn)室，測(cè)量中萼片、花瓣、子房、合蕊柱的大小。

1.2.2 人工授粉

參考李桂琳等[13]方法。于盛花期的早晨進(jìn)行人工授粉，設(shè)置自花授粉、同株異花、異株異花3個(gè)處理，授粉花朵數(shù)視實(shí)際情況而定，授粉時(shí)用大頭針輕輕挑開藥帽后輕沾花粉粒放到待授粉花朵的蕊腔里，輕壓使其與蕊腔緊密接觸。授粉前后1d內(nèi)不澆水。授粉7～14d后觀察授粉花朵狀態(tài)，包括花柄、花瓣、子房變化情況，統(tǒng)計(jì)結(jié)實(shí)數(shù)并計(jì)算結(jié)實(shí)率，公式：

結(jié)實(shí)率/%=(結(jié)實(shí)個(gè)數(shù)/授粉花朵數(shù))×100

1.2.3 蒴果形態(tài)特征研究

參考周慧君等[14]方法。授粉140～150d后，摘下未開裂的蒴果，帶回實(shí)驗(yàn)室，隨機(jī)選取10個(gè)蒴果，測(cè)量蒴果的長、寬、果柄長和重并記錄，打開果莢取出種子混合，制片9張，每張片子隨機(jī)選取5個(gè)視野，在生物顯微鏡(4×)下觀察并記錄種子數(shù)量和有胚種子數(shù)量，計(jì)算種子有胚率。公式：

種子有胚率/%=(有胚種子個(gè)數(shù)/種子總個(gè)數(shù))×100

取部分混合后的種子放入離心管中，加入0.5%TTC染色液，28℃培養(yǎng)12h后，制片9張，每張片子隨機(jī)選取5個(gè)視野，在顯微鏡(4×)下觀察種子染色情況，紅色則為有活力種子，計(jì)算種子生活力。公式：

種子生活力/%=(有活力的種子數(shù)/觀察種子總數(shù))×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果用Excel 2019進(jìn)行初步整理，用SPSS 26對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 梵凈山石斛花期各階段特性及花部結(jié)構(gòu)測(cè)定

梵凈山石斛花期可分為花芽萌動(dòng)期、始蕾期、現(xiàn)蕾期、露色期、始花期、盛花期、末花期7個(gè)時(shí)期。花芽萌動(dòng)期約在3月初出現(xiàn)，在節(jié)間形成突起的萌動(dòng)的花芽，見圖1a；3月中旬左右，綠色的花蕾開始出現(xiàn)，為始蕾期，見圖1b；花蕾出現(xiàn)約7d后，花蕾大面積露出，為現(xiàn)蕾期，見圖1c；5d左右后，花柄出現(xiàn)，花蕾顏色進(jìn)一步加深，為露色期，見圖1d；露色期到始花期需要3～9d，之后很快進(jìn)入盛花期，見圖1e、圖1f。據(jù)觀察，種植于貴州省植物園大棚溫室的梵凈山石斛花期比野外環(huán)境下(梵凈山)花期提前20d左右，這是由于溫度影響，溫度高花期會(huì)提前。

注：1為中萼片；2為花瓣；3為側(cè)萼片；4為唇瓣。

從表1、圖1可知，梵凈山石斛花呈橙黃色和黃褐色，萼片和花瓣顏色從里到外逐漸加深，花瓣近橢圓形，中萼片長12.8～18.0mm，寬4.0～5.5mm，花瓣長12.1～17.0mm，寬3.8～6.0mm，子房長21.4～31.0mm，唇瓣外部橙黃色或黃褐色，中部具有一條紫色斑塊，邊緣白色，合蕊柱長9.2～11.50mm，合蕊柱寬2.2～5.2mm，合蕊柱長1.8～2.9mm，藥帽乳白色，花粉塊黃色。

表1 梵凈山石斛花部結(jié)構(gòu)大小

2.2 梵凈山石斛人工授粉研究

梵凈山石斛花朵人工授粉后3～4d開始枯萎，7d左右花朵基部開始膨大形成蒴果，則表明授粉成功。由表2可知，梵凈山石斛自花授粉和同株異花授粉均不能結(jié)實(shí)，僅異株異花能成功結(jié)實(shí)，結(jié)實(shí)率為43.24%，說明梵凈山石斛異交親和，自交不親和性。

表2 梵凈山石斛人工授粉結(jié)實(shí)率

表3 蒴果形態(tài)特征及種子發(fā)育情況

2.3 蒴果形態(tài)特征研究

從圖2a可知，梵凈山石斛授粉成功后，花朵枯萎基部逐漸膨大，從而形成蒴果，膨大期為4月，隨后進(jìn)入生長期，授粉140～150d后，蒴果未開裂時(shí)可采摘，此時(shí)種子呈粉塵狀且可以快速抖落，可用于無菌播種。取授粉140～150d后的蒴果進(jìn)行形態(tài)觀察，見圖2b，得出蒴果綠色，紡錘形，長2.22～3.12cm，寬0.72～1.24cm，果柄長0.50～3.36cm，單粒蒴果平均重為0.90g；將蒴果切開，觀察梵凈山石斛種子，見圖2c，其為黃色，粉末狀，小，數(shù)量多。通過生物顯微鏡觀察可知，其種子呈細(xì)長船型，兩端較窄，中間較寬，胚位于種子中間較寬部分。梵凈山石斛種子大部分為有胚種子，無胚種子較少，種子有胚率在82.26%～97.35%，平均種子有胚率為91.73%，通過TTC染色法測(cè)定種子活力，得出種子生活力在73.08%～92.66%，平均種子生活力為86.92%，表明人工授粉后的梵凈山石斛種子胚發(fā)育較好，生活力較強(qiáng)。

注：1為無胚種子；2為有胚種子；3為未被染色的種子；4為被染色的種子。

3 討論與結(jié)論

梵凈山石斛花期3—4月，開花進(jìn)程可分為花芽萌動(dòng)期、始蕾期、現(xiàn)蕾期、露色期、始花期、盛花期、末花期7個(gè)時(shí)期。其花具有2種顏色，橙黃色和黃褐色，顏色從里到外逐漸加深，表明其花朵具有較高的觀賞性，觀賞價(jià)值高。花器官中，平均中萼片長15.21mm，寬4.79mm，子房長21.4～31.0mm，平均合蕊柱長10.54mm，合蕊柱寬4.10mm，合蕊柱長2.12mm。

石斛屬植物自交親和性存在差異，可表現(xiàn)為異交親和，異交和自交都親和，自交親和[10]；文獻(xiàn)報(bào)道，翅萼石斛、棒節(jié)石斛、玫瑰石斛、晶帽石斛、黃花石斛、金釵石斛自花授粉、同株異花以及異株異花授粉均能結(jié)實(shí)，其中玫瑰石斛自花授粉結(jié)實(shí)率最高[13，16]，表明其均存在自交和異交親和；梵凈山石斛自花授粉和同株異花授粉結(jié)實(shí)率均為0，只有異花授粉才能授粉成功獲得蒴果，表明梵凈山石斛存在自交不親和，異交親和，與束花石斛[10]、喇叭唇石斛[15]一樣。

本試驗(yàn)對(duì)人工授粉的蒴果進(jìn)行種實(shí)發(fā)育觀測(cè)，結(jié)果表明，梵凈山石斛蒴果平均長2.57cm，寬0.92cm，單粒平均0.90g。種子有胚率平均數(shù)可達(dá)91.73%，平均種子生活力可達(dá)86.92%，表明采用人工授粉方式獲得的種子胚發(fā)育較好，生活力較強(qiáng)，具有一定的萌發(fā)能力，適合于作為無菌播種的材料。

研究瀕危植物開花物候和繁育系統(tǒng)有利于了解其繁育過程的限制影響因子，從而通過人為干預(yù)，促進(jìn)其保護(hù)[17]，因此，繁育特性研究是梵凈山石斛保育的重要研究內(nèi)容，本試驗(yàn)對(duì)梵凈山石斛開花特性、人工授粉以及蒴果的發(fā)育進(jìn)行了觀測(cè)，為其保育提供基礎(chǔ)資料。