脊柱側彎動物模型制備方法的研究進展

馮鞏,徐燁,趙旭,馮其金

(天津中醫藥大學第二附屬醫院,天津 300150)

脊柱側彎是脊柱的非正常彎曲,是一種脊柱的三維畸形,包括冠狀位、矢狀位和軸位上的序列異常[1]。脊柱側彎可分為早發性脊柱側彎[2]、青少年脊柱側彎[3]以及成人脊柱側彎[4],其具體病因尚未完全明確,可能與基因遺傳[5]、內分泌[6]、神經肌肉系統病變[7]等因素有關。脊柱側彎的治療方法因側彎的嚴重程度而異,輕度脊柱側彎通常采用佩戴支具、按摩及功能鍛煉等方法進行矯正,而對于Cobb角≥40°的脊柱側彎則建議手術治療,但一次手術難以達到預期效果,通常需要翻修手術[8]。為明確脊柱側彎的發病原因以及尋找更好的治療方法,研究者們建立了各種脊柱側彎動物模型。本文就脊柱側彎動物模型制備方法的研究進展進行了綜述,以期為脊柱側彎的相關研究提供參考。

1 手術機械類模型制備

目前通過手術內固定制備脊柱側彎模型已經相對成熟[9]。通過四足動物制備手術機械類脊柱側彎模型的操作方法主要包括:①切除肋骨;②椎骨或肋骨相互固定。上述方法均在不改變椎體本身結構的情況下,使脊柱或支撐組織失去平衡,在此類動物模型中脊柱側彎的進展同脊柱側彎患者的病情進展一致。長期平臥的人類可以出現脊柱側彎[10],表明重力不是脊柱側彎發病的先決條件,所以四足動物脊柱側彎模型的制備具有一定的科學性。Meiring等[11]研究認為,通過切除對側肋骨及椎弓根螺釘固定能誘發特發性脊柱畸形。Sunni等[12]通過研究發現,對牛脊柱進行椎體融合術后,可使牛的Cobb角增加約30°,而且還發現牛椎體骺板均有不同程度的損傷,說明過大的應力在增加Cobb角的同時會損傷脊柱。Gross等[13]對實驗豬進行了如下手術操作:①于T10～T11左側開胸;②于T9和T11放置螺釘;③T10椎體部分切除;④橫斷棘間韌帶;⑤螺釘周圍放置鋼絲圈并擰緊。其實驗結果發現,術后即刻6只豬的Cobb角為30.5°±1.0°,術后5周內Cobb角不斷增加,實驗結束時Cobb角為50.3°±7.2°。出現該實驗現象的原因可能是豬的體重不斷增加(實驗豬初始體質量約為10 kg,實驗結束時體質量約為25 kg),此觀點與Laubach等[14]的觀點一致。此外,通過支具外固定也能制備脊柱側彎動物模型。Banala等[15]用支具外固定小鼠脊柱5周后,發現小鼠Cobb角約為50°,而摘除支具后7周,小鼠的Cobb角卻減小了10°～20°。

綜上所述,通過內固定和支具外固定都能制備脊柱側彎動物模型,內固定能夠形成長期穩定的Cobb角,缺點是會損傷實驗動物,制備成本高,對個體較小的實驗動物操作較難;支具外固定的優勢在于方便經濟,劣勢在于實驗后形成的Cobb角在支具撤離的一段時間后會減小。

2 基因類模型制備

隨著基因測序技術的不斷發展,脊柱側彎遺傳學相關研究迅速增加。目前已知與脊柱側彎相關的基因包括TBX6、NPR2、ZMYND10、BNC52、POC5、ZIC3、NKAP等[16]。盡管越來越多的研究發現脊柱側彎與遺傳變異有關,但其潛在的作用機制仍有待進一步研究。通過基因編輯建立動物模型,可觀察脊柱發育過程中存在一系列分子生物學的異常,進而確定遺傳因素在脊柱側彎發病機制中的作用。

脊柱的發育方式主要為軟骨內成骨。骨軟骨病樣變化可導致豬脊柱出現后凸,因此通過誘導骨軟骨病樣變化,能夠制備與軟骨相關的脊柱側彎基因模型[17]。Halanski等[18]通過減少山羊母體維生素D的攝取,發現其后代也出現了脊柱側彎。TAQL(RS731236)基因以及維生素D受體均參與維生素D的代謝途徑,因此誘導維生素D作用路徑相關基因突變,可使脊柱發生側彎。Isaac等[19]以抗肌萎縮蛋白、肌營養不良蛋白雙敲除小鼠作為肌肉骨骼過早老化模型,結果顯示實驗小鼠的骨礦物質密度和含量均顯著降低,此現象同杜氏肌肉營養不良癥患者的表現一致。從基因水平上抑制鈣離子攝取以及減緩成骨細胞活躍性是造成脊柱強度不均而發生側彎的一個重要途徑。此外,肌萎縮蛋白缺乏可引起肌肉萎縮,同時也可導致骨質流失,誘發退行性脊柱側彎[20]。故影響鈣離子跨膜吸收相關基因CABP-D9K、TRPV6的表達,可減少實驗動物胃腸道對鈣離子的吸收,減弱脊柱抗應力的能力,使椎體發生移位而形成側彎。

SAMP8小鼠是一種快速老化小鼠,是研究退行性脊柱側彎的理想動物模型。Hu等[21]通過麻醉下截斷SAMP8小鼠的前肢及尾巴來模擬人直立行走的實驗研究,發現SAMP8小鼠的椎間盤發生了退變,包括椎間盤高度的減少和椎骨骨贅的形成,而且SAMP8小鼠發生脊柱側彎率為100%。這說明衰老、椎間盤退化及椎體骨贅的形成與退行性脊柱側彎的發生有一定的潛在關系。以上模型能為脊柱側彎基因方面的研究提供幫助,但不同基因模型可重復率有差異,且基因編碼動物較普通實驗動物昂貴。

3 神經肌肉類模型制備

神經元異常在神經肌肉性脊柱側彎中起著重要作用[22],Van Gennip等[23]通過實驗進一步驗證了該觀點。Assaraf等[24]的研究結果顯示,神經元中缺乏piezo2的小鼠患脊柱側彎的概率高于正常小鼠。Kamal等[25]對雷諾綜合征小鼠進行研究后發現,小鼠的骨剛度和骨負荷降低以及神經元異常可導致脊柱兩側的力學分布存在差異。在青少年特發性脊柱側彎患者中,神經炎癥和氧化過激也扮演著重要角色。sspO蛋白是一種高分子糖蛋白,參與低密度脂蛋白識別。該蛋白與低密度脂蛋白對神經起到調節作用,sspO 蛋白缺乏能夠誘導神經炎癥。Rose等[26]通過對斑馬魚使用sspO表達抑制劑,制備出了斑馬魚脊柱側彎模型。

肌肉的力學特性對人體力量的生成和控制發揮著至關重要的作用。肌肉力學失衡被認為是導致脊柱側彎的原因之一[27]。脊柱兩旁的肌肉力學平衡維持著脊柱的正常形態,當一側肌肉過度牽拉或萎縮,脊柱雙側力學就會失衡,從而發生脊柱側彎。Xie等[28]研究發現,脊柱雙側肌肉的生物力學特征與肌肉纖維和膠原分布的差異相關。剝離實驗動物單側椎旁肌來模擬脊椎雙側力學失衡,可制備出符合條件的脊柱側彎動物模型。該模型制備過程簡易,但需注意肌肉剝離過程中對神經的損傷。杜氏肌肉營養不良癥是由功能性肌營養不良蛋白喪失引起的,其特征是肌纖維肌膜缺乏抗肌營養不良蛋白的表達,該病與75%～90%的脊柱側彎有關。Isaac等[19]以抗肌萎縮蛋白、肌營養不良蛋白雙敲除小鼠和C57BL/10小鼠為研究對象,結果發現這2種小鼠均出現明顯的脊柱側彎,但前一種小鼠發生側彎的比例高于后一種小鼠,且側彎的角度也大于后一種小鼠。Wang等[29]通過對C57BL/6小鼠腹部注射地塞米松后發現,注射地塞米松的小鼠比正常小鼠體重減輕了15.7%,而其全身脂肪含量較正常小鼠更高。地塞米松能誘導小鼠肌肉發育不良,對小鼠局部注射地塞米松可使小鼠脊柱兩側力學失衡而出現側彎。

此類模型同手術機械類模型相似,均可直接改變脊柱兩側力學,其優點在于能夠驗證側彎發生的原因,可重復性較強,而手術機械類模型則多用于脊柱側彎治療方法的療效評價。

4 內分泌類模型制備

1959年,Thillard首次報道切除雞體內松果體可制造出與人類脊柱側彎解剖特征類似的脊柱畸形[30]。此后許多研究者提出褪黑素的合成和代謝缺陷是導致脊柱側彎的關鍵因素。目前已有研究表明,褪黑素缺乏與青少年特發性脊柱側彎的發病機制有關[31]。褪黑素是松果體分泌的一種神經內分泌激素[32]。切除雞體內松果體是一種早期脊柱側彎動物模型的制備方法。目前缺乏褪黑素的C57BL/6J小鼠是另一種理想的脊柱側彎動物模型,該模型的優點在于血清素N-乙酰轉移酶(該酶在褪黑素的合成中必不可少)基因的自然敲除,而無需切除松果體[33]。Liu等[34]對C57BL/6J小鼠進行外源性褪黑素干預,結果發現干預15周時約90%的C57BL/6J小鼠出現了脊柱側彎,Cobb角平均約為21°,而接受褪黑素治療的小鼠僅有約5%的小鼠出現了脊柱側彎;在干預20周時未接受褪黑素治療的小鼠骨小梁間距明顯寬于接受褪黑素治療的小鼠,但2組小鼠骨小梁數量并未有明顯差異。由此可推測,褪黑素可通過改變骨小梁之間的間距來影響骨強度,進而誘發脊柱側彎。Yang等[35]對雙足大鼠腹部注射褪黑素拮抗劑Luzindole,經過6個月的實驗觀察,發現使用Luzindole的雙足大鼠脊柱側彎率及側彎程度均高于未使用Luzindole的雙足大鼠;但對正常大鼠使用Luzindole后,并未出現明顯側彎。這表明單純褪黑素缺乏并不能直接使脊柱發生側彎。除褪黑素外,較低水平的雄激素也能影響女性青少年特發性脊柱側彎患者的軟骨發育,異常的軟骨發育會加劇脊柱側彎進程[36]。在青少年特發性脊柱側彎患者中絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路中SPRY4基因下調最嚴重[37],SPRY4基因可在褪黑素作用下上調,并以EK-ERK1/2依賴性方式促進成骨分化和褪黑素反應。對實驗動物進行SPRY4基因敲除或注射SPRY4抗體,可使MAPK信號通路中SPRY4基因下調,破壞成骨分化,使脊柱出現側彎。

5 小 結

手術機械類動物模型制備的可重復性強,適合新型內外固定方法治療脊柱側彎的研究,但在制備過程中應嚴格把控初始Cobb角;基因類動物模型制備成本較高,但能為脊柱側彎基因方面的研究提供幫助;神經肌肉類動物模型制備的可重復性也較強,能驗證脊柱側彎發生的原因;內分泌類動物模型更適合藥物治療脊柱側彎的研究。相信隨著科學的不斷進步,脊柱側彎模型的制備方法將會不斷完善,脊柱側彎的發病機制也將更加清晰。