視黃酸相關(guān)孤兒受體α對阿霉素誘導(dǎo)心肌損傷的改善作用及機(jī)制研究

付 莉,黃 晶,苗 娜,王志強(qiáng)

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科,新疆 烏魯木齊 830054;2.新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院,新疆 烏魯木齊 830054)

心臟損傷在臨床上比較常見,多指心肌損害后繼發(fā)的心臟大小、結(jié)構(gòu)、形狀的任何改變,病理特征表現(xiàn)為病理性心肌細(xì)胞肥大、心肌細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積[1-4]。阿霉素(Doxorubicin,DOX)屬于蒽環(huán)類藥物,是白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多種疾病的有效化療藥物,但是長期服用DOX可導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用,尤其是心臟毒性最為明顯[5-6]。主要表現(xiàn)為心肌活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)增加,心肌細(xì)胞凋亡,心肌能量代謝受損,線粒體功能障礙[7-8],但機(jī)制并不清楚。視黃酸相關(guān)孤兒受體(Retinoic acid receptor-related orphan receptor,ROR)是一種核受體,包括RORα、RORβ和RORγ[9]。RORα不僅是調(diào)節(jié)生物節(jié)律的重要分子,而且在胚胎發(fā)育和生物代謝中也發(fā)揮重要作用[10-14]。RORα表達(dá)于心肌組織,并且參與心肌細(xì)胞的凋亡、自噬、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等生理病理過程[15],但是其在DOX誘導(dǎo)的心肌損傷研究并未報道。因此,本研究通過建立心臟RORα過表達(dá)模型,探討RORα在DOX誘導(dǎo)的心肌損傷中的改善作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性C57/BL6J小鼠80只,6～8周齡,18～22 g,購于新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院。所有小鼠均在相同的溫度和濕度下喂養(yǎng),環(huán)境溫度保持在(24±3)℃,濕度保持在33%～68%,小鼠可自由飲食。

1.2 主要試劑 慢病毒(LV-GFP)和RORα過表達(dá)慢病毒(LV-RORα)購于漢恒生物技術(shù)公司;DOX(批號:H33021980)購于上海翊圣生物公司;兔抗MnSOD(批號:R910708)和RORα(批號:R910708)抗體購于美國CST公司;DAPI染色液(批號:D796852)購于上海翊圣生物公司;辣根過氧化物酶(HPR)標(biāo)記二抗(批號:7074)購于天津三箭生物公司;TUNEL試劑盒購于美國羅氏公司;血漿肌酸激酶(CK)(批號:C0023)、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(批號:C0016)和ROS檢測試劑盒(批號:CA1410)購于上海碧云天生物公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠心肌RORα過表達(dá)模型建立和實(shí)驗(yàn)分組:將NC慢病毒和RORα過表達(dá)慢病毒2×107TU采用尾靜脈注射的方法注射到小鼠體內(nèi)。2周后檢測心肌RORα表達(dá),心肌RORα高表達(dá)為模型建立成功。隨機(jī)將小鼠分為NC組、RORα過表達(dá)組、DOX組和RORα過表達(dá)+DOX組,每組20只。其中,DOX組和RORα過表達(dá)組一次性給予15 mg/(kg·d)DOX腹腔注射;NC組和RORα過表達(dá)組給予同等體積0.9%氯化鈉溶液腹腔注射。

1.3.2 小鼠心功能檢測:將小鼠平躺于實(shí)驗(yàn)臺上,異氟烷吸入麻醉,根據(jù)小鼠體重計(jì)算麻醉深度。取少量螯合劑涂于小鼠胸前,超聲探頭對著小鼠心前區(qū)采集M型超聲圖像并保存。分析M型超聲圖像結(jié)果,評估心功能,計(jì)算小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左心室短軸縮短率(LVFS)。

1.3.3 血漿心肌酶CK和LDH活性檢測:各組小鼠頸靜脈取血,血液置于EP管中,800 r/min離心。后續(xù)步驟按照CK和LDH試劑盒的要求進(jìn)行,記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.3.4 心肌凋亡水平檢測:常規(guī)處死小鼠,迅速取出小鼠心臟,在預(yù)冷的PBS中將小鼠心臟血液洗掉,吸水紙吸干心臟上的PBS。將心臟置于4%多聚甲醛中固定,常規(guī)石蠟包埋切片,脫蠟入水。使用Triton-X100進(jìn)行破膜后用PBS清洗,利用TUNEL染色劑和DAPI常規(guī)進(jìn)行染色,最后封片。熒光顯微鏡下隨機(jī)選取10個視野觀察,計(jì)算凋亡率。

1.3.5 線粒體形態(tài)觀察:常規(guī)處死小鼠,迅速取出小鼠心臟,在預(yù)冷的PBS中將小鼠心臟血液洗掉,吸水紙吸干心臟上的PBS。將左室心肌切成1 mm×1 mm×1 mm的小塊,置于2.5%磷酸緩沖液配制的固定液中固定。梯度脫水后,常規(guī)包埋和固化,切片,3%醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染。透射電鏡下進(jìn)行觀察,采集圖片并保存。

1.3.6 心肌ROS蛋白表達(dá)檢測:使用比色法檢測心肌ROS含量。裂解心肌后提取蛋白,采用ROS檢測試劑盒進(jìn)行檢測。

1.3.7 RORα和MnSOD蛋白表達(dá)檢測:迅速分離小鼠心臟,將心臟血液用預(yù)冷的PBS洗掉,RIPA裂解液裂解心肌組織,提取組織蛋白。使用BCA法定量蛋白。加入相應(yīng)體積的5×上樣緩沖液,煮5 min。配膠,上樣,電泳,轉(zhuǎn)膜,牛奶封閉,孵育兔抗RORα一抗(1∶800)和兔抗MnSOD一抗(1∶800)過夜。次日孵育相應(yīng)二抗(1∶50000)和ECL顯影,保存并分析圖片。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠心肌RORα蛋白表達(dá)比較 見圖1。與NC組比較,DOX組RORα蛋白表達(dá)水平降低,RORα過表達(dá)組和RORα過表達(dá)+DOX組RORα蛋白表達(dá)升高(均P<0.05)。

注:左圖為各組小鼠心肌RORα蛋白電泳結(jié)果。右圖中,與NC組比較,*P<0.05;與DOX組比較,#P<0.05

2.2 各組小鼠LVEF和LVFS比較 見圖2。與NC組比較,DOX組LVEF和LVFS降低(均P<0.05)。與DOX組比較,RORα過表達(dá)+DOX組LVFS和LVEF升高(均P<0.05)。NC組和RORα過表達(dá)組LVFS和LVEF比較差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

注:與NC組比較,*P<0.05;與DOX組比較,#P<0.05

2.3 各組小鼠血漿CK和LDH活性比較 見圖3。與NC組比較,DOX組CK、LDH活性增加(均P<0.05)。與DOX組比較,RORα過表達(dá)+DOX組CK、LDH活性降低(均P<0.05)。NC組和RORα過表達(dá)組CK、LDH活性比較差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

注:與NC組比較,*P<0.05;與DOX組比較,#P<0.05

2.4 各組小鼠心肌凋亡水平比較 見圖4。與NC組比較,DOX組TUNEL陽性心肌細(xì)胞增加(P<0.05)。與DOX組比較,RORα過表達(dá)+DOX組TUNEL陽性心肌細(xì)胞減少(P<0.05)。NC組和RORα過表達(dá)組TUNEL陽性心肌細(xì)胞數(shù)比較差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

注:左圖為各組小鼠心肌細(xì)胞染色結(jié)果(TUNEL染色,×20;DAPI染色,×400)。右圖中,與NC組比較,*P<0.05;與DOX組比較,#P<0.05

2.5 各組小鼠心肌線粒體形態(tài)比較 見圖5。NC組和RORα過表達(dá)組心肌纖維排列整齊,肌小節(jié)清晰可見,線粒體均勻分布于心肌纖維內(nèi),線粒體嵴及其邊緣清晰,大小形態(tài)正常。DOX組肌纖維雜亂,肌小節(jié)裂解,線粒體腫脹,線粒體嵴斷裂,個別線粒體已經(jīng)成為空泡狀,有明顯的線粒體損傷。RORα過表達(dá)+DOX組肌纖維形態(tài)尚可,肌小節(jié)模糊不清,線粒體稍腫脹,線粒體邊緣和線粒體嵴模糊。

圖5 各組小鼠心肌線粒體形態(tài)透射電鏡圖(×30000)

2.6 各組小鼠心肌ROS和MnSOD表達(dá)比較 見圖6。與NC組比較,DOX組心肌ROS水平增加,MnSOD蛋白表達(dá)降低(均P<0.05)。與DOX組比較,RORα過表達(dá)+DOX組心肌ROS水平降低,MnSOD蛋白表達(dá)增加(均P<0.05)。

注:與NC組比較,*P<0.05;與DOX組比較,#P<0.05

3 討 論

DOX是一種重要的細(xì)胞毒性化療藥物,有著較為廣泛的抗腫瘤譜,已廣泛應(yīng)用于乳腺癌、肺癌、甲狀腺癌以及其他實(shí)體癌和血液癌的治療,但是心臟毒性限制了其臨床應(yīng)用[16-17]。其抗腫瘤活性的機(jī)制是插入DNA堿基對以及抑制癌細(xì)胞中拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ?qū)е翫NA損傷和細(xì)胞死亡。但研究[18]表明,蒽環(huán)類藥物衍生物引起的心臟毒性占化療相關(guān)心臟毒性的30%以上,因此需要一種特定的方法來預(yù)防和減輕心臟不良反應(yīng)。有研究[19]發(fā)現(xiàn),在接受DOX治療的腫瘤患者中,DOX心臟毒性可達(dá)到60%,嚴(yán)重影響了DOX的臨床適應(yīng)證的擴(kuò)大。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),多種機(jī)制及分子參與了DOX所誘發(fā)的心肌損傷,ROS的過多產(chǎn)生、心肌細(xì)胞凋亡、能量代謝損傷、鈣超載以及線粒體功能障礙可能都與其相關(guān)。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),RORα在生物周期調(diào)節(jié)、生物發(fā)育、代謝調(diào)節(jié)和腫瘤發(fā)生等生理病理以及晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)和褪黑激素效應(yīng)調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵性的作用。RORα表達(dá)于心臟組織、心肌細(xì)胞和血管,可能在心血管保護(hù)中也發(fā)揮著重要的作用,但其作用機(jī)制目前尚不清楚。

研究發(fā)現(xiàn),與正常小鼠比較,糖尿病小鼠心肌組織中RORα表達(dá)降低;與野生糖尿病小鼠比較, RORα敲除糖尿病小鼠心功能顯著降低,而RORα過表達(dá)糖尿病小鼠心功能有顯著改善。Beak等[20]研究發(fā)現(xiàn),在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥大模型中,模型小鼠的心肌組織中RORα表達(dá)水平較正常小鼠顯著降低。本研究中,與NC組比較,DOX組RORα蛋白表達(dá)水平顯著降低,RORα過表達(dá)組和RORα過表達(dá)+DOX組RORα蛋白表達(dá)水平顯著升高,提示RORα可能是一種新的特異性保護(hù)因素,可能成為重要的心血管保護(hù)靶點(diǎn)。

Zhao等[21]研究發(fā)現(xiàn),RORα可以通過激活單磷酸腺苷激活蛋白激酶/過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子α(AMPK/PGCα)信號通路和改善線粒體合成對高脂誘導(dǎo)的心肌損傷起到保護(hù)作用。本研究中,RORα過表達(dá)+DOX組肌纖維形態(tài)尚可,肌小節(jié)模糊不清,線粒體稍腫脹,線粒體邊緣和線粒體嵴模糊,提示過表達(dá)RORα可改善DOX誘導(dǎo)的心肌線粒體損傷。

有文獻(xiàn)顯示,氧化應(yīng)激參與了DOX誘導(dǎo)的心肌損傷過程,抗氧化酶MnSOD可能發(fā)揮著重要的作用。在本研究中我們首次發(fā)現(xiàn),過表達(dá)RORα可減少心肌ROS水平,同時增加了MnSOD表達(dá),提示過表達(dá)RORα可改善DOX誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激,RORα可能通過調(diào)控MnSOD表達(dá)降低心肌ROS水平而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

綜上所述,本研究通過尾靜脈注射RORα病毒建立小鼠心肌RORα過表達(dá)模型,初步驗(yàn)證了RORα過表達(dá)對DOX誘導(dǎo)的心肌損傷中的影響,RORα可能通過激活MnSOD抑制氧化應(yīng)激而發(fā)揮保護(hù)作用。RORα可能是DOX誘導(dǎo)的心肌損傷的重要靶點(diǎn),研制針對此靶點(diǎn)的治療藥物可能對于增加DOX的安全性和擴(kuò)大DOX的臨床應(yīng)用范圍具有重要而現(xiàn)實(shí)的意義。本研究也有一定的不足之處:一是只在動物實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了RORα在DOX誘導(dǎo)的心肌損傷中的作用,未在RORα細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證;二是RORα可能激活MnSOD抑制氧化應(yīng)激的機(jī)制尚不清楚,還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。