膽綠素還原酶A rs699512和肝細(xì)胞溶質(zhì)載體有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員1B1 rs4149015位點(diǎn)基因多態(tài)性與新生兒不明原因高膽紅素血癥易感性相關(guān)性研究

杜 晨,徐 征,高 宇,夏蘭蘭,李 燁,李 寧

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院保定醫(yī)院檢驗(yàn)科,河北 保定 071000;2.陸軍第八十二集團(tuán)軍醫(yī)院檢驗(yàn)科,河北 保定 071000;3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院保定醫(yī)院新生兒科,河北 保定 071000)

高膽紅素血癥(Hyperbilirubinemia,HB)是新生兒較為常見的一種疾病,據(jù)統(tǒng)計(jì)其發(fā)病率超過55%,其中20%～30%是不明原因HB[1]。由于病因無法明確,增加了臨床診斷與治療難度,若患兒未得到及時(shí)有效治療,極易發(fā)生膽紅素腦病,甚至引發(fā)不可逆神經(jīng)系統(tǒng)損害,因此明確易感基因?qū)π纬上到y(tǒng)防治體系至關(guān)重要[2-3]。膽綠素還原酶A(Biliverdin reductase A,BLVRA)可通過還原膽綠素生成非結(jié)合型膽紅素,參與HB發(fā)生過程[4]。肝細(xì)胞溶質(zhì)載體有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員1B1(Solute carrier organic anion transporter family member 1B1,SLCO1B1)是有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)因子1B1(Organic anion transportingpolypeptide 1B1,OATP1B1)的編碼基因,具有較高的遺傳變異性,在肝臟轉(zhuǎn)載膽紅素過程中發(fā)揮重要作用[5]。但目前關(guān)于BLVRA和SLCO1B1基因位點(diǎn)在不明原因HB中的研究較少。基于此,本研究探討B(tài)LVRA rs699512與SLCO1B1 rs4149015位點(diǎn)基因多態(tài)性在新生兒不明原因HB中的作用及意義,為臨床制定針對(duì)性防治方案提供借鑒。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2022年1月至2023年1月于本院分娩和治療的新生兒不明原因HB患兒90例為HB組,另選取同期健康新生兒90例作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn):新生兒不明原因HB符合《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》[6]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn);健康新生兒檢查各項(xiàng)指標(biāo)正常;出生日齡<28 d;兩組監(jiān)護(hù)人均對(duì)本研究知情,自愿簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):參與本研究前應(yīng)用磺胺類、水楊酸類等影響膽紅素代謝的藥物者;伴有染色體異常、遺傳性代謝性疾病者;存在先天性心臟病、先天畸形、先天性膽管閉鎖、紅細(xì)胞增多癥、血管外溶血者;合并甲狀腺功能異常者;合并感染性疾病者;母嬰血型不合者。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)(倫理批號(hào):TJIRB20201002)。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集:收集所有研究對(duì)象的一般資料,包括性別、胎齡、出生體重、開奶時(shí)間、紅細(xì)胞壓積、總膽紅素和結(jié)合膽紅素等數(shù)據(jù)。

1.2.2 基因多態(tài)性檢測(cè):采集清晨空腹靜脈血2 ml,利用TIANGEN試劑盒提取DNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)量樣品DNA純度與濃度,確認(rèn)合格后保存于4 ℃冰箱內(nèi)。采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法檢測(cè)BLVRA rs699512和SLCO1B1 rs4149015位點(diǎn)基因多態(tài)性。PCR引物序列由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì),PCR反應(yīng)體系體積25 μl,反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性20 s,57 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,循環(huán)37次;72 ℃延伸10 min。取5 μl DNA擴(kuò)增片段行限制性內(nèi)切酶消化反應(yīng)與瓊脂糖電泳,在紫外燈光透視下分析BLVRA rs699512、SLCO1B1 rs4149015位點(diǎn)基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果。委托華大基因科技股份有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序,采用Mutation Surveyor 4.0軟件進(jìn)行基因序列比對(duì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料比較 見表1。HB組患兒總膽紅素和結(jié)合膽紅素水平明顯高于對(duì)照組(均P<0.05)。兩組其他資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 兩組BLVRA rs699512位點(diǎn)基因型分布和等位基因比較 見表2。兩組BLVRA rs699512位點(diǎn)基因型分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.202,P=0.010)。HB組GG基因型分布高于對(duì)照組,AA基因型分布低于對(duì)照組(均P<0.05)。HB組G等位基因頻率高于對(duì)照組(P<0.05)。

表2 兩組BLVRA rs699512基因型分布和等位基因比較[例(%)]

2.3 兩組SLCO1B1 rs4149015位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率比較 見表3。兩組SLCO1B1 rs4149015位點(diǎn)基因型分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.751,P=0.013)。HB組AA基因型分布高于對(duì)照組,GG基因型分布低于對(duì)照組(均P<0.05)。HB組A等位基因頻率高于對(duì)照組(P<0.05)。

表3 兩組SLCO1B1 rs4149015基因型分布和等位基因比較[例(%)]

2.4 不同BLVRA rs699512基因型患兒血清膽紅素水平比較 見表4。不同BLVRA rs699512基因型患兒總膽紅素和結(jié)合膽紅素水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。BLVRA rs699512中GG基因型總膽紅素和結(jié)合膽紅素水平高于AA基因型(均P<0.05)。

表4 不同BLVRA rs699512基因型患兒血清膽紅素水平比較(μmol/L)

2.5 不同SLCO1B1 rs4149015基因型患兒血清膽紅素水平比較 見表5。不同SLCO1B1 rs4149015基因型患兒總膽紅素和結(jié)合膽紅素水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。SLCO1B1 rs4149015中AA基因型總膽紅素和結(jié)合膽紅素水平高于GG基因型(均P<0.05)。

表5 不同SLCO1B1 rs4149015基因型患兒血清膽紅素水平比較(μmol/L)

2.6 BLVRA rs699512、SLCO1B1 rs4149015位點(diǎn)基因多態(tài)性與HB易感性的關(guān)系 BLVRA rs699512位點(diǎn)GG基因型與HB發(fā)生呈正相關(guān),AA基因型與HB發(fā)生呈負(fù)相關(guān)(r=0.671、-0.608,均P<0.001)。SLCO1B1 rs4149015位點(diǎn)AA基因型與HB發(fā)生呈正相關(guān),GG基因型與HB發(fā)生呈負(fù)相關(guān)(r=0.695、-0.633,均P<0.001)。

3 討 論

新生兒不明原因HB在臨床較為常見,且近年來發(fā)病率逐年升高,成為全球兒科醫(yī)師面臨的重要難題[7-8]。HB發(fā)生的主要原因包括遺傳和圍生期因素,雖然大多患兒經(jīng)光療治療后均可痊愈,但仍有部分患兒可能會(huì)發(fā)展成膽紅素腦病,影響患兒的神經(jīng)系統(tǒng),留下后遺癥,甚至對(duì)其生命帶來威脅[9-10]。膽紅素在機(jī)體內(nèi)主要由血紅素降解,但80%以上降解由網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中紅細(xì)胞血紅蛋白完成,剩余降解由骨髓中低效的紅細(xì)胞生成和其他血紅素蛋白完成[11-12]。在血紅素加氧酶催化分解下,血紅素可被分解為等分子量膽綠素、一氧化碳和鐵,其中BLVRA可將膽綠素降解,使其轉(zhuǎn)變?yōu)槟懠t素,當(dāng)其進(jìn)入血液后可參與機(jī)體血液循環(huán),同時(shí)與血清白蛋白結(jié)合,經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)后特異性分布于肝臟并在肝細(xì)胞基底膜上的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)攝取,最終進(jìn)入肝細(xì)胞[13]。膽紅素進(jìn)入細(xì)胞后可與受體蛋白相結(jié)合并降解于光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),在尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶催化后可進(jìn)一步生產(chǎn)結(jié)合膽紅素,其可在水中相融并隨之排出體外[14]。

BLVRA是一種膽綠素還原酶,在機(jī)體內(nèi)具體機(jī)制為:體內(nèi)BLVRA蛋白可結(jié)合血紅蛋白加氧酶-1(HO-1)蛋白,導(dǎo)致其發(fā)生催化作用同時(shí)對(duì)兔血紅素氧合酶1(HMOX1)行應(yīng)激誘導(dǎo),增加其表達(dá)[15]。因此,理論而言HMOX1多態(tài)性可對(duì)膽紅素水平產(chǎn)生影響,兩者間應(yīng)存在密切聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn),BLVRA rs699512位點(diǎn)GG基因型與HB發(fā)生呈正相關(guān),AA基因型與HB發(fā)生呈負(fù)相關(guān)。在單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)中,有研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于BLVRA基因中rs699512位點(diǎn)突變存在異議,其等位基因頻率明顯不同,其中白種人、中國(guó)人和日本人分別為0.23、0.27和0.40[16],但Chau等[17]研究指出,BLVRA rs699512位點(diǎn)基因與成人血清膽紅素?zé)o顯著關(guān)系,本研究與其存在差異,本研究發(fā)現(xiàn)HB組患兒BLVRA rs699512位點(diǎn)基因G等位基因頻率明顯高于對(duì)照組,GG基因型分布明顯高于對(duì)照組,AA基因型分布明顯低于對(duì)照組,GG基因型總膽紅素水平和結(jié)合膽紅素明顯高于AA基因型,提示BLVRA抑制劑可能對(duì)不明HB的發(fā)生具有明顯改善作用。分析原因,主要是由于rs699512位點(diǎn)A>G堿基置換可進(jìn)一步加快氨基酸-蘇氨酸的轉(zhuǎn)變,而蛋白酶的活性與蘇氨酸之間存在密切關(guān)系,從而改變BLVRA蛋白酶活性[18];此外,由于BLVRA是一類HO-1轉(zhuǎn)錄因子,在機(jī)體內(nèi)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中參與并發(fā)揮作用,可抑制其合成并降低膽紅素的生成[19]。因此,推測(cè)BLVRA rs699512位點(diǎn)基因?qū)LVRA生成產(chǎn)生影響,進(jìn)而降低膽紅素的合成,但具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

SLCO1B1基因位于染色體12p12,在漿膜中的變異表達(dá)減少會(huì)在一定程度上降低有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽2轉(zhuǎn)運(yùn)活性,未結(jié)合膽紅素?zé)o法完成轉(zhuǎn)運(yùn),導(dǎo)致其在體內(nèi)聚集,引起新生兒不明HB的發(fā)生[20]。本研究發(fā)現(xiàn),HB組患兒SLCO1B1 rs4149015位點(diǎn)基因A等位基因頻率明顯高于對(duì)照組,AA基因型分布明顯高于對(duì)照組,GG基因型分布明顯低于對(duì)照組,且AA基因型總膽紅素水平和結(jié)合膽紅素明顯高于GG基因型。與以往研究不同,Amandito等[21]研究發(fā)現(xiàn)SLCO1B1基因位點(diǎn)與新生兒不明原因HB無關(guān)。分析原因,可能是由于不同地區(qū)人群可能存在遺傳有差異[22]。總之,目前在新生兒不明原因高膽紅素血癥中關(guān)于SLCO1B1 rs4149015位點(diǎn)基因的研究較少,且結(jié)果爭(zhēng)議較大,今后尚待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本研究。

綜上所述,新生兒不明原因HB患兒BLVRA rs699512位點(diǎn)GG基因型與SLCO1B1 rs4149015位點(diǎn)AA基因型會(huì)顯著增加易感性,臨床可建立早期防治體系以改善患兒預(yù)后。