肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1 V600E基因及生長分化因子15表達變化與甲狀腺乳頭狀癌患者淋巴結轉移及預后關系研究

葉宗媛,許 雪,胡 娟

(合肥市第一人民醫院病理科,安徽 合肥 230061)

甲狀腺癌為頭頸部常見惡性腫瘤之一[1]。甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC)為甲狀腺癌主要病理類型,其相對懶惰特性使患者10年生存率超過90%,但是在發病早期較易出現淋巴結轉移[2-4]。研究[5-6]顯示,淋巴結轉移是PTC患者腫瘤遠處轉移及預后不良的重要危險因素,因此研究者一直致力于盡早發現淋巴結轉移,并予以針對性干預治療,以改善患者預后。肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1(V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1,BRAF)基因作為RAF蛋白家族組成重要成員之一,被激活后可以磷酸化絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK),進而激活下游促有絲分裂信號細胞外調節蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinase,ERK),其突變是導致多種惡性腫瘤發生及進展的重要原因之一[7]。研究[8]顯示,單一BRAF V600E基因突變出現在超過95%惡性腫瘤中,而PTC患者病灶中存在BRAF V600E基因突變,但是其是否與PTC患者淋巴結轉移及預后不良有關尚需要進一步研究證實。生長分化因子15(Growth differentiation factor 15,GDF-15)是轉化生長因子家族重要組成成員之一,可能與惡性腫瘤細胞增殖與侵襲關系密切,已被證實與多種惡性腫瘤發生關系密切[9-10]。基于此,本研究探究BRAF V600F基因及GDF-15表達變化與PTC患者淋巴結轉移及預后的關系,為后期PTC患者病情評估及預后改善提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2020年1月至2022年12月本院病理科確診的出現淋巴結轉移的PTC患者60例為研究組,收集同期無淋巴結轉移的PTC患者53例為對照組。研究組中,男性29例,女性31例;年齡22～73歲,平均(42.13±14.74)歲。對照組中,男性13例,女性40例;年齡23～70歲,平均(47.00±12.07)歲。兩組患者一般資料比較差異無統計學意義(均P>0.05)。病例納入標準:患者病情依據甲狀腺結節和分化型甲狀腺癌診治指南[11]及術后病理檢測確診;淋巴結是否轉移依據淋巴結清掃術后病理予以證實;患者精神意識正常,可以配合研究中各項調查;患者知情同意。排除標準:合并其他類型腫瘤者;其他病理類型甲狀腺癌者。研究進行獲得患者知情同意,且符合《赫爾辛基宣言》中倫理學標準。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集:收集研究組患者性別、年齡、腫瘤直徑、病理分型、包膜浸潤等臨床特征資料。

1.2.2 樣本收集:手術獲得樣本常規制片,行HE染色后光學顯微鏡下觀察。在顯微鏡下標記腫瘤病灶部位,選擇腫瘤部位進行切片,盡可能避開鈣化及出血部位,切下蠟膜(厚度5 μm)后轉移至潔凈離心管中待測。

1.2.3 BRAF V600E基因檢測:腫瘤組織中BRAF V600E基因突變情況采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應進行測定。收集石蠟組織采用DNA提取試劑盒[批號:20190625,天根生化科技(北京)有限公司]提取DNA。DNA純度及濃度采用紫外分光光度計進行測定。DNA稀釋至5 μg/L后采用BRAF V600E基因突變檢測試劑盒(批號:20191019,廈門艾德生物醫藥科技有限公司)進行測定,所有步驟嚴格按照試劑說明書進行。熒光定量聚合酶鏈式反應儀測定參數:95 ℃條件下預變性處理10 min;95 ℃條件下退火處理15 s,60 ℃條件下延伸處理60 s,共進行40個循環。獲得結果后依據Ct值大小判斷是否出現基因突變,若是Ct值≤35則表示出現基因突變。

1.2.4 GDF-15表達檢測:采用EnVision二步法試劑盒[批號:20190822,賽默飛世爾科技(中國)有限公司]進行測定。石蠟切片脫蠟后采用抗原修復液修復15 min,雙氧水(0.3%)封閉3 min,一抗孵育后置于4 ℃環境中過夜。第2天棄去一抗并沖洗后滴加二抗,室溫環境下孵育30 min,隨后添加DAB室溫顯色5 min,蘇木素復染處理后應用中性樹膠封閉。免疫組化結果由2位高年資高職稱醫師以雙盲法予以判定,隨機統計5個高倍鏡視野中100個腫瘤細胞中陽性細胞占比,參照切片中陽性染色程度與陽性細胞數占比綜合評定染色結果[12],陽性細胞為細胞膜或者細胞質中有清晰淡黃色顆粒或者棕褐色顆粒。陽性細胞占比計分:陽性細胞數占比<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分別為0、1、2、3、4分。細胞染色程度計分:無陽性染色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別計分0、1、2、3分。兩項相乘后評分≥2分為陽性。

1.2.5 預后隨訪:所有患者均接受隨訪以評估預后,隨訪終末期為2023年1月30日或者患者病情進展甚至死亡。患者病情進展甚至死亡為預后不良,否則為預后良好。

1.3 觀察指標 比較兩組患者BRAF V600E基因及GDF-15陽性表達差異;分析兩指標與淋巴結轉移患者臨床特征之間關系;分析兩指標對PTC患者淋巴結轉移的預測價值,以及兩指標與PTC患者預后間的關系。

1.4 統計學方法 采用SPSS 20.0統計學軟件分析數據。計數資料以[例(%)] 表示,行χ2檢驗;預測價值應用受試者工作特征(ROC)曲線進行分析;預后應用Kaplan-Meier生存曲線進行分析;P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組患者BRAF V600E基因突變及GDF-15陽性表達情況比較 見表1。研究組患者BRAF V600E基因突變率及GDF-15陽性表達率高于對照組(均P<0.05)。

2.2 BRAF V600E基因突變及GDF-15陽性表達與淋巴結轉移患者臨床特征的關系 見表2。BRAF V600E基因突變、GDF-15陽性表達與淋巴結轉移患者腫瘤直徑、是否包膜侵犯有關(均P<0.05),而與患者性別、年齡、病灶類型無關(均P>0.05)。

表2 BRAF V600E基因突變及GDF-15陽性表達與淋巴結轉移患者臨床特征的關系[例(%)]

2.3 BRAF V600E基因突變及GDF-15陽性表達對淋巴結轉移的預測價值 見表3。ROC曲線分析顯示,BRAF V600E基因突變及GDF-15陽性表達對PTC患者淋巴結轉移均具有一定的預測價值,兩項聯合的預測價值更高(均P<0.05)。

表3 BRAF V600E基因突變及GDF-15陽性表達對淋巴結轉移的預測價值

2.4 BRAF V600E基因及GDF-15表達與PTC患者預后間的關系 見圖1。60例PTC患者中,失訪2例,余58例患者隨訪時間為11～35個月,中位隨訪時間為19.3個月。隨訪期間6例患者死亡,19例患者病情進展,即預后不良患者25例,預后良好患者33例。Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示,BRAF V600E基因突變患者累積無進展生存率低于BRAF V600E基因未突變患者(Log-Rank χ2=10.555,P<0.05),GDF-15陽性表達患者累積無進展生存率低于GDF-15陰性表達患者(Log-Rank χ2=9.213,P<0.05)。

3 討 論

BRAF突變多發生于外顯子11與15,其突變類型主要為T1799A突變,嘌呤嘧啶取代處于1799位點位置的胸腺嘧啶,導致對應蛋白質中600位點中賴氨酸被谷氨酸替代而發生BRAF V600E突變[13-14]。本研究結果顯示,研究組患者BRAF V600E基因突變率較對照組高,表明PTC患者淋巴結轉移可能與BRAF V600E基因突變有關。分析認為,BRAF V600E基因突變導致BRAF基因結構出現變化,無需RAS基因作用即可不斷激活MAPK/ERK,導致PTC患者病情進一步惡化而發生淋巴結轉移[15-17]。研究[18]顯示,PTC患者BRAF V600E突變率相對較高,其高侵擾性生物學行為是導致患者淋巴結轉移風險增加的主要原因,因此該研究將BRAF V600E突變作為淋巴結轉移獨立預測因子,以便為患者手術淋巴結清掃提供合適參考依據。本研究中,BRAF V600E基因預測患者淋巴結轉移的AUC為0.642,顯示BRAF V600E基因突變用于預測PTC患者淋巴結轉移有一定價值,間接證明BRAF V600E基因突變與PTC患者淋巴結轉移關系密切。

Zhou等[18]研究顯示,當PTC患者腫瘤直徑≥5 mm時,BRAF V600E突變陽性患者的中央區淋巴結轉移發生率顯著升高,顯示BRAF V600E突變是中央區淋巴結轉移發生的獨立危險因素,與本研究結果相似。本研究還發現,BRAF V600E基因突變與淋巴結轉移患者腫瘤直徑、是否包膜侵犯有關,顯示BRAF V600E基因突變可能與患者臨床特征關系密切,參與了PTC發生、進展過程,但是其具體作用機制尚需要進一步研究予以證實。國外研究[19]顯示,野生型BRAF淋巴結轉移的死亡風險沒有增加,但具有BRAF突變的淋巴結轉移患者死亡風險相對較高,與本研究中不同BRAF V600E基因突變情況患者累積無進展生存率分析結果一致。

GDF-15在炎癥、缺氧以及腫瘤發生等病理過程中經由多種途徑影響細胞免疫應答過程。此外,其還可以在腫瘤發生早期抑制腫瘤細胞生長,在晚期促進腫瘤生長[20-21]。研究[22-23]顯示,結直腸癌、腎細胞癌患者體內血清GDF-15水平明顯上升,參與了腫瘤細胞增殖、侵襲及轉移等多種惡性生理學過程。本研究結果顯示,相對于無淋巴結轉移PTC患者,存在淋巴結轉移的PTC患者GDF-15陽性表達率較高,顯示淋巴結轉移與患者體內GDF-15表達有關,這可能與GDF-15導致原癌基因受體絡氨酸酶激活從而促進腫瘤發生與進展有關[24]。國外研究[25]認為,腫瘤患者體內GDF-15促癌或者抑癌作用主要由細胞所處環境及狀態決定,正常情況下其可以抑制腫瘤細胞生長,而腫瘤發生晚期其表達則會促進腫瘤干細胞形成、對治療敏感性降低及免疫逃逸發生。倪志強等[26]研究顯示,GDF-17在轉移病灶中高表達,且與腫瘤直徑、臨床分期等臨床特征關系密切,與本研究結果一致。本研究結果顯示,GDF-15陽性表達患者累積無進展生存率顯著低于GDF-15陰性表達患者,顯示GDF-15表達與患者預后關系密切,GDF-15表達陽性患者腫瘤直徑大,患者病情嚴重,預后不良風險相對較高。Kang等[27]研究顯示,GDF-15高表達所致腫瘤侵襲性是患者預后不良的主要原因,認為GDF-15是一種線粒體應激誘導甲狀腺癌腫瘤細胞產生的有絲分裂因子,GDF-15誘導的轉錄活化因子3激活決定了甲狀腺癌病情進展,可能是導致患者預后不良主要原因。

此外,本研究還發現,BRAF V600E基因突變聯合GDF-15陽性表達預測PTC患者淋巴結轉移的AUC為0.719,高于兩項指標的預測價值,提示兩者可能在淋巴結轉移中發揮協同作用,但是其具體作用機制尚需要后續研究進一步證實,

綜上所述,PTC患者BRAF V600E基因及GDF-15表達變化與PTC患者淋巴結轉移及預后關系密切,均可能參與了PTC病情發生及進展過程,可以作為患者病情評估及預后的預測指標。