核苷酸剪切修復基因mRNA和蛋白對頭頸部鱗狀細胞癌發生的預測價值研究

張 令,王 寧,許 楠,張曉彤,韓 鵬

(1.西安交通大學第一附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科,陜西 西安 710061;2.西安交通大學第二附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科,陜西 西安 710004;3.神木市醫院耳鼻喉科,陜西 神木 719300;4.西安市鄠邑區人民醫院耳鼻喉科,陜西 西安 710300)

頭頸部鱗狀細胞癌(Head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)是常見的惡性腫瘤之一[1-2]。由于HNSCC生存率較低且總體預后相對較差,給患者帶來極大痛苦[3-4]。核苷酸剪切修復(Nucleotide excision repair,NER)通路在DNA修復中扮演重要角色,其功能多樣化[5-7]。既往研究[8-10]發現,30多個基因參與NER通路來修復損傷DNA,NER通路可以修復受紫外線輻射損傷的DNA。一些化學物質(如煙草燃燒過程產生的苯并芘)可以與DNA內核苷酸殘余的堿基成分發生反應進而生成一種塊狀加合物,該物質會導致正常的DNA螺旋結構發生扭曲。NER通路在去除這些加合物的過程中發揮重要作用,可修復約70%由環境因素引起的DNA損傷[11-13]。

既往研究[14-17]表明,NER基因mRNA和蛋白表達水平降低分別與HNSCC的易感性增加有關,但單一轉錄或翻譯水平的NER通路標志物在預測HNSCC發病風險上具有一定的局限性。目前,將兩種NER表型相結合來預測HNSCC發病風險的研究較少。因此,本研究探討NER基因9個核心mRNA和蛋白的表達水平對HNSCC發病風險的預測價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究選取2015年1月至2021年12月就診于西安交通大學第一附屬醫院的HNSCC患者98例為病例組,另選取18歲及以上健康人群95例為對照組。本研究僅選取中國漢族人群作為研究對象。病例納入標準:新診斷為HNSCC;年齡≥18歲;未接受過手術治療(除診斷性穿刺術);未患過其他腫瘤;病理診斷為口腔、咽部(除外鼻咽部)及喉部的SCC。排除標準:年齡<18歲;不愿提供相應血液標本;中途退出研究;接受過任何化療或放療。本研究通過西安交通大學第一附屬醫院倫理委員會審批,所有入選研究對象均被告知相關風險并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 TRIzol法提取RNA:從血液標本中提取淋巴細胞,將淋巴細胞棄培養液,用磷酸鹽緩沖液清洗細胞培養板/瓶。每孔加入TRIzol試劑1 ml,裂解細胞,置入1.5 ml EP管中,震蕩60 s,并在室溫下放置13 min。在4 ℃下將裂解液離心15 min,離心后樣品分層,吸取上層RNA。取上清液至清潔的EP管中,離心13 min,棄上清液,可見沉于管底的RNA。取1 ml 75%乙醇加入沉淀中,離心13 min,棄除上清液。將EP管倒置于濾紙上5 min,測定OD值。將RNA反轉錄成cDNA,并置于-80 ℃冰箱中。

1.2.2 熒光定量PCR檢測NER基因mRNA表達:每個擴增反應在引物和Master混合物的體系中進行,95 ℃ 5 min,變性15 s,40 ℃循環,60 ℃退火/延伸。以18S為內參,通過ΔCt值計算9個NER基因的表達水平,ΔCt值越小表示mRNA表達水平越高。所有NER基因mRNA及18S rRNA引物由美國Applied Biosystems公司提供。

1.2.3 反相蛋白微陣列(RPPA)實驗:通過Aushon 2470點樣儀將裂解物置于載玻片上,將含有抗原的樣品放置3份。每個載玻片用一抗和偶聯的二抗進行檢測,將檢測芯片與每個抗體在室溫下孵育。使用Dako Cytomation-Catalyzed系統擴增信號,然后通過DAB比色反應顯現信號。使用Array-Pro Analyzer軟件對芯片上的信號進行掃描和分析,以確定光電強度,隨后將其通過Logistic回歸的R包進行處理。

2 結 果

2.1 兩組患者一般資料比較 病例組年齡25～72歲,平均(55.22±12.45)歲。對照組年齡23～74歲,平均(55.48±14.27)歲。兩組年齡比較差異無統計學意義(t=0.617,P=0.638)。病例組71.64%和對照組76.25%為男性,病例組28.36%和對照組23.75%為女性,兩組性別構成比較差異無統計學意義(χ2=32.214,P=0.271)。與對照組比較,病例組吸煙占比較高(58.23%與65.16%,χ2=52.245,P=0.028)。與對照組比較,病例組飲酒人群比例相對較多,差異無統計學意義(66.31%與68.17%,χ2=45.653,P=0.105)。

2.2 兩組患者NER基因mRNA和蛋白質表達水平比較 見表1。與對照組比較,病例組XPA mRNA和蛋白表達降低,XPB mRNA表達降低(均P<0.05)。

表1 兩組患者NER基因mRNA和蛋白質表達水平比較

2.3 HNSCC發生影響因素Logistic回歸分析 見表2。根據對照組的中位水平將病例組NER mRNA和蛋白劃分為高、低表達水平。以XPA蛋白(≥0.206=0,<0.206=1)、XPA mRNA(>19.85=0,≤19.85=1)、XPB蛋白(≥0.582=0,<0.582=1)、XPB mRNA(>19.34=0,≤19.34=1)為自變量,以是否發生HNSCC(否=0,是=1)為因變量行Logistic回歸分析,結果顯示XPA mRNA≤19.85和XPA蛋白<0.206是HNSCC發生的獨立危險因素(均P<0.05)。

表2 HNSCC發生影響因素Logistic回歸分析

2.4 NER基因mRNA和蛋白表達對HNSCC發生的預測價值 見表3。單獨XPA蛋白、XPA mRNA以及兩者聯合預測HNSCC發生的AUC分別為0.637、0.592、0.674。兩者聯合的AUC大于單獨XPA蛋白的AUC和單獨XPA mRNA的AUC(P=0.016、0.001)。

表3 NER基因mRNA和蛋白表達對HNSCC發生的預測價值

3 討 論

既往研究[15,17]證實,NER基因mRNA或蛋白表達水平降低分別與HNSCC易感性增加有關。由于NER通路中單一表型對HNSCC風險預測的效能有限,因此我們將NER基因蛋白和mRNA的表達水平聯合作為一個新的水平來預測HNSCC的發病風險。 本研究結果顯示,NER基因蛋白和mRNA聯合比單獨一種表型更有效地預測HNSCC的風險。

國外研究[17]發現,HNSCC風險的增加與XPD、XPF、XPA和XPC蛋白表達水平的降低間存在相關性,因沒有合適的DDB1和XPB抗體,因此無法進行相關檢測。由于中國漢族人群中HNSCC的組成與非西班牙裔白種人有很大不同,本研究檢測了中國漢族人群中9種核心NER基因蛋白的表達水平并驗證了與HNSCC發病風險間的關系,發現XPA mRNA和蛋白表達降低與HNSCC發病風險增加相關。以上結果進一步支持NER通路的翻譯水平改變可能導致HNSCC的發病風險增加,與轉錄水平相比,NER通路的翻譯水平對NER修復能力有直接影響這一觀點。既往對轉錄水平的研究[15]表明,在中國漢族人群中XPB mRNA表達水平的降低與HNSCC風險增加有關。然而,在本研究中,在翻譯水平上未發現HNSCC與XPB的相關性。造成這種差異的原因可能是目前的研究樣本量不夠大。而且,NER基因的轉錄和翻譯水平可能不直接相關。雖然NER基因的mRNA最終被翻譯成NER蛋白,但轉錄和翻譯過程可能遠不止是簡單的線性相關,其進一步機制可能是順式作用和反式作用過程構造了一系列系統,促進或抑制從一定拷貝數的mRNA分子合成蛋白質,而翻譯水平更直接地參與NER修復過程[17]。

組成XPA蛋白的結構域包括能夠與轉錄因子ⅡH肽1(GTF2H1)相互作用的C端結構域,與RNA聚合酶Ⅰ亞基和ERCC1結合位點的N端結構域以及負責DNA結合的中心結構域,這些結構域功能的變異可能導致NER過程異常,進而增加癌癥的易感性[18-20]。本研究結果發現,在漢族人群中HNSCC的易感性增加與XPA mRNA和蛋白表達水平降低有關。目前的結果與既往研究的非西班牙裔白人關于HNSCC風險研究一致,表明XPA可能是兩個種族中HNSCC普遍的生物標志物。

雖然對NER mRNA表達水平的檢測易進行,但PCR檢測結果可能會因不同的細胞階段而波動。因此,從轉錄水平的數據來預測HNSCC的風險可能是不穩定的,需要另一個試驗來證實PCR試驗的結果。RPPA法是一種快速、經濟、高效的檢測NER蛋白表達水平的方法[17]。既往研究在非西班牙裔白種人中,采用ROC曲線評估了NER蛋白對HNSCC發病風險預測的效能,發現與未包含XPB和XPA表達水平相比,包含XPB和XPA表達水平的AUC顯著改善[17]。本研究發現,與僅包含NER蛋白或mRNA的表達水平相比, 兩者聯合能顯著提高AUC。這些結果進一步表明,結合NER通路的兩種表型可以顯著提HNSCC風險預測的有效性。

綜上所述,XPA mRNA和蛋白表達水平是HNSCC發生的影響因素,兩者聯合對HNSCC發生的預測價值高于單獨預測。