積雪草酸對大鼠絕經后骨質疏松癥的治療作用及機制研究

張亮亮,趙程錦,周煜虎,曹 博,段明明,馮陽陽

(延安大學附屬醫院創傷骨科,陜西 延安 716000)

骨質疏松癥(Osteoporosis,OP)是一種常見的骨代謝疾病,與骨量減少、骨質退變、骨微結構變化相關,在一定程度上可增加骨的脆性,降低骨荷載承受力,最終導致患者出現慢性疼痛并增加骨折的風險,嚴重影響患者日常生活與健康[1]。研究[2]發現我國50歲以上OP女性發病率為29.0%,且呈逐年增長趨勢。目前尋找更加有效的防治絕經后OP的藥物已成為當務之急。積雪草酸是一種五環三萜酸,為傳統中草藥積雪草的有效成分,具有抗癌、抗氧化、抗炎、保肝等作用。研究[3]報道積雪草酸可有效抑制OP,但其具體的分子機制仍有待探討。Hedgehog信號通路在進化過程中高度保守,已有研究[4]指出通過調節Hedgehog信號通路可有效治療OP。然而積雪草酸能否通過介導Hedgehog信號通路調節絕經后OP尚未可知。故本研究通過SD大鼠實驗探討上述問題,為OP患者新藥的研發提供方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只2～3月齡雌性SD大鼠,無特定病原體(SPF)級,體重250～270 g,購自武漢大學動物實驗中心,分籠飼養。生產許可證號和使用許可證號分別為SCXK(鄂)2019-0004、SYXK(鄂)2019-0013。本研究經醫院倫理委員會審批通過(審批號:院準字2019第012號)。

1.2 主要試劑 HE染色試劑盒(批號:G1120-100)購自北京索萊寶科技有限公司;苯甲酸雌二醇(批號:YT0939)購自北京伊塔生物科技有限公司;積雪草酸(批號:J12643)購自上海金穗生物科技有限公司;大鼠骨堿性磷酸酶(BALP)酶聯免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒、Ⅰ型膠原交聯氨基端肽(NTX-Ⅰ)ELISA試劑盒(批號:EK-R37372、EK-R36686)購自上海酶研生物科技有限公司;大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)ELISA試劑盒(批號:MM-0620R1)購自武漢益普生物科技有限公司;總RNA提取試劑盒(批號:SOS-1207)購自北京凱詩源生物科技有限公司;音猬因子(SHH)、細胞表面跨膜蛋白Patched1(Ptc1)、7次跨膜蛋白(Smo)、Gli家族鋅指蛋白-1(Gli1)、矮小相關轉錄因子2(Runx2)、成骨細胞特異性轉錄因子(Osx)、骨保護素(OPG)、細胞核因子-κB受體活化因子(RANKL)、磷酸脫氫酶(GAPDH)聚合酶鏈反應(PCR)引物委托金唯智生物公司合成;總蛋白提取試劑盒(批號:SN-002)購自英文特生物技術(北京)有限公司;核蛋白提取試劑盒(批號:BB-31813)購自上海貝博生物科技公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(批號:E112-01)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;兔抗鼠SHH、Ptc1、Smo、Gli1、Runx2、Osx、OPG、RANKL、GAPDH、組蛋白3(H3)單克隆抗體(一抗,批號:2207S、MA5-24893、ab229258、ab151796、Q13950、ab236465、BS1862、PA5-110268、ab190304、ab1791),羊抗兔SHH、Ptc1、Smo、Gli1、Runx2、Osx、OPG、RANKL、GAPDH、H3辣根過氧化物酶標記多克隆抗體(二抗,批號:31461、A16124、A16116、32460、A27036、A16110、31460、G-21234、A16096、31463)購自無錫云萃生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模及鑒定、分組與給藥:①采用一次性手術摘除雙側卵巢造模法[5]構建絕經后OP大鼠模型,將卵巢組織完整切除,兩側卵巢組織摘除后逐層縫合,關閉創口。假手術組僅切除雙側卵巢附近脂肪組織。②常規麻醉處理后,取造模組和假手術組各1只大鼠處死,取右側股骨,固定后常規脫水,石蠟包埋切片(5 μm);脫蠟脫水后蘇木素染色5 min,分化后伊紅復染2 min,脫水,透明,封片,光學顯微鏡下觀察,股骨切片出現骨小梁疏松變薄、間隙變寬等情況表明造模成功[6]。③將建模成功大鼠分為模型組(9只)、雌二醇組(10只)、積雪草酸低劑量組(10只)、積雪草酸中劑量組(10只)和積雪草酸高劑量組(10只)。雌二醇組于皮下注射0.02 mg/(kg·d)苯甲酸雌二醇。積雪草酸低、中、高劑量組分別予以50、100、200 mg/(kg·d)積雪草酸灌胃,假手術組(9只)和模型組分別給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃,1次/d,持續12周。

1.3.2 各組大鼠骨組織病理改變:給藥結束后禁食24 h,常規麻醉后取各組大鼠右后肢股骨近端1/3組織,HE染色操作同1.3.1。

1.3.3 各組大鼠骨密度(BMD)和微結構檢測:給藥結束后禁食24 h,取各組大鼠右后肢股骨遠端1/3行Micro-CT掃描成像。Micro-CT掃描股骨遠端1/3后,對其進行三維重建,獲取骨小梁三維重建結構圖像,并使用Micro-CT自帶軟件分析骨小梁三維微結構并采集骨小梁空間結構參數,包括骨密度(BMD)、骨體積分數(BV/TV)、結構模式指數(SMI)、骨小梁數目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)。

1.3.4 各組大鼠血清BALP、NTX-Ⅰ和TRAP水平:給藥結束后禁食24 h,取各組大鼠腹主動脈血1.5 ml,3000 r/min離心15 min(離心半徑8.8 cm),取上清,按照ELISA試劑盒操作說明檢測各組大鼠血清BALP、NTX-Ⅰ和TRAP水平。

1.3.5 各組大鼠骨組織SHH、Ptc1、Smo、Gli1、Runx2、Osx、OPG、RANKL mRNA表達檢測:采用實時反轉錄聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測。給藥結束后禁食24 h,取各組大鼠左后肢1/2股骨,提取骨組織總RNA,反轉錄合成cDNA后進行RCR反應,引物序列見表1。反應條件:95 ℃ 5 min;94 ℃ 40 s,60 ℃ 40 s,72 ℃ 40 s,30個循環;72 ℃ 5 min。采用2-ΔΔCt法計算待測基因mRNA相對表達水平。

1.3.6 各組大鼠骨組織SHH、Ptc1、Smo、Gli1、Runx2、Osx、OPG、RANKL蛋白表達檢測(Western blot):給藥結束后禁食24 h,取各組大鼠左后肢剩余1/2股骨,液氮將其粉碎為粉末,加細胞裂解液,4 ℃下12000 r/min離心20 min(有效離心半徑8.8 cm),取上清得SHH、Ptc1、Smo、Runx2、Osx、OPG、RANKL總蛋白。同時,根據核蛋白提取試劑盒提取Gli1核蛋白,采用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度,調整終濃度為4 μg/μl。上樣5 μl,電泳,轉膜后封閉2 h,加一抗(稀釋比例1∶500)4 ℃孵育過夜,更換二抗(稀釋比例1∶2000)室溫孵育2 h,顯色,分析待測待測基因蛋白條帶灰度值。其中Gli1基因選取H3為內參基因,其余基因選取GAPDH為內參基因。

2 結 果

2.1 各組大鼠骨組織病理改變情況 見圖1。假手術組大鼠骨小梁網狀結構清晰、排列有序,基本結構正常;模型組大鼠骨小梁結構明顯異常,骨小梁斷裂、不完整、網狀結構消失;雌二醇組和積雪草酸低劑量組骨小梁斷裂改善;積雪草酸中劑量組骨小梁斷裂進一步改善;積雪草酸高劑量組骨小梁結構基本趨于正常。

2.2 各組大鼠骨密度和微結構指標比較 見表2。與假手術組比較,模型組大鼠股骨BMD、BV/TV、Tb.N以及Tb.Th下降,SMI和Tb.Sp上升(均P<0.05)。與模型組比較,雌二醇組和積雪草酸低、中、高劑量組大鼠股骨BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th上升,SMI和Tb.Sp下降(均P<0.05)。雌二醇組和積雪草酸低劑量組上述指標比較差異無統計學意義(均P>0.05)。積雪草酸低、中、高劑量組上述指標呈劑量依賴性(均P<0.05)。

表2 各組大鼠骨密度和微結構指標比較

2.3 各組大鼠血清BALP、NTX-Ⅰ和TRAP水平比較 見表3。與假手術組比較,模型組大鼠血清BALP水平下降,NTX-Ⅰ和TRAP水平上升(均P<0.05)。與模型組比較,雌二醇組和積雪草酸低、中、高劑量組血清BALP水平上升,NTX-Ⅰ和TRAP水平下降(均P<0.05)。雌二醇組和積雪草酸低劑量組上述指標比較差異無統計學意義(均P>0.05)。上述指標積雪草酸低、中、高劑量組上述指標呈劑量依賴性(均P<0.05)。

表3 各組大鼠血清BALP、NTX-Ⅰ和TRAP水平比較

2.4 各組大鼠骨組織SHH、Ptc1、Smo、Gli1、Runx2、OPG、Osx、RANKL mRNA表達比較 見表4、5。與假手術組比較,模型組大鼠骨組織SHH、Ptc1、Smo、Gli1、Runx2、OPG、Osx mRNA表達下降,RANKL mRNA表達上升(均P<0.05)。與模型組比較,雌二醇組和積雪草酸低、中、高劑量組SHH、Ptc1、Smo、Gli1、Runx2、OPG、Osx mRNA表達上升,RANKL mRNA表達下降(均P<0.05)。雌二醇組和積雪草酸低劑量組上述指標比較差異無統計學意義(均P>0.05)。積雪草酸低、中、高劑量組上述指標呈劑量依賴性(均P<0.05)。

表4 各組大鼠骨組織SHH、Ptc1、Smo、Gli1 mRNA表達比較

表5 各組大鼠骨組織Runx2、Osx、OPG、RANKL mRNA表達比較

2.5 各組大鼠骨組織SHH、Ptc1、Smo、Gli1、Runx2、OPG、Osx、RANKL蛋白表達比較 見表6、7。與假手術組比較,模型組大鼠骨組織SHH、Ptc1、Smo、Gli1、Runx2、OPG、Osx蛋白表達下降,RANKL蛋白表達上升(均P<0.05)。與模型組比較,雌二醇組和積雪草酸低、中、高劑量組SHH、Ptc1、Smo、Gli1、Runx2、OPG、Osx蛋白表達上升,RANKL蛋白表達下降(均P<0.05)。雌二醇組和積雪草酸低劑量組上述指標比較差異無統計學意義(均P>0.05)。積雪草酸低、中、高劑量組上述指標呈劑量依賴性(均P<0.05)。

表6 各組大鼠骨組織SHH、Ptc1、Smo、Gli1蛋白表達比較

表7 各組大鼠骨組織Runx2、Osx、OPG、RANKL蛋白表達比較

3 討 論

OP與內分泌功能失常、營養缺失、遺傳因素及免疫因素密切相關[7]。目前臨床上多采用藥物治療并結合生活方式的調整和康復治療共同進行,必要時進行手術治療,盡管具有一定療效,但存在不良反應、治療周期長、無法治愈等問題,與此同時OP所引發的骨折等并發癥嚴重危害人體健康,給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔[8-9],因此急需尋找高效防治OP的藥物。

本研究結果顯示,建模組大鼠骨組織出現骨髓腔增大、骨小梁斷裂等情況,表明本研究成功構建絕經后OP模型。雌二醇可有效抑制OP,故本研究選取其為陽性藥物。本研究表明,積雪草酸可改善骨組織病理情況和骨組織微結構,上調骨組織BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th水平,下調SMI和Tb.Sp水平,上調血清BALP水平,下調NTX-Ⅰ和TRAP水平,發揮抑制絕經后OP的作用。血清BALP反映成骨細胞活性。郭建邦等[10]研究指出OP患者治療后血清BALP水平升高。血清膠原降解標志物NTX-Ⅰ及破骨細胞分泌的TRAP則反映骨吸收速率。Alrowaili等[11]研究指出,OP大鼠體內NTX-Ⅰ水平上升,而治療后水平下降,OP得到緩解。Yildirim等[12]研究指出,OP大鼠骨密度降低伴隨血液TRAP升高。本研究結果與上述研究結果一致。

本研究結果還表明,積雪草酸可促進SHH、Ptc1、Smo、Gli1、Runx2、Osx、OPG mRNA和蛋白表達,抑制RANKL mRNA和蛋白表達,發揮治療絕經后OP的作用。Hedgehog信號通路由Hedgehog信號蛋白(如SHH等)、Ptc1與Smo特異性受體、Gli蛋白和下游靶基因組成,當Hedgehog蛋白缺失時,下游的Gli蛋白進入細胞核內抑制下游靶基因轉錄,而當Hedgehog蛋白表達上升時,Gli與其他分子結合形成大分子復合物進入細胞核內激活下游靶基因的轉錄[13]。已有研究[14]表明,通過激活Hedgehog信號通路可有效治療OP。Runx2和Osx在骨形成過程中發揮重要作用。Takebe等[15]研究指出,通過介導Hedgehog信號通路促進Runx2、Osx表達,可促進骨折愈合過程中的骨形成。OPG和RANKL是骨吸收的重要調控因子。宋斌等[16]研究指出,通過調控Hedgehog信號通路促進Runx2、OPG表達,抑制RANKL表達,可明顯改善OP中的骨代謝。Deng等[17]研究指出,通過調節Hedgehog信號通路,促進Runx2表達,上調BALP水平,可改善骨組織損傷。Zhang等[18]研究指出,通過激活Hedgehog信號通路抑制RANKL和TRAP表達,可抑制破骨細胞形成和骨丟失。本研究結果與上述研究結果相符。另外,楊帆等[19]研究發現積雪草酸可促進健康人牙周膜細胞成骨分化,證實積雪草酸對骨形成有調控作用;陳曉駟等[20]報道指出積雪草酸可增加OP模型大鼠Runx2蛋白表達,且能夠改善其生物力學特性,增加骨小梁面積。本研究結果與上述報道均提示積雪草酸在OP治療中具有良好的開發與應用價值。

綜上所述,積雪草酸可調節絕經后OP骨代謝,可能通過激活Hedgehog信號通路促進Runx2、Osx、OPG表達,抑制RANKL表達,上調BALP水平,下調NTX-Ⅰ和TRAP水平,發揮對絕經后OP的治療作用,且呈劑量依賴性。但是關于積雪草酸改善OP骨代謝是否存在其他分子機制,積雪草酸是否與Hedgehog通路激活劑的效應等同,以及該成分在OP患者臨床治療中應用的有效性與安全性并不十分明確,且積雪草酸的批量獲取及生產是否能實現也是需要考慮的問題,后續均需深入探討研究。