基于網絡藥理學和分子對接技術探討腎炎康復片治療IgA腎病的作用機制

林雪萍 陳智鴻 滕 杰

復旦大學附屬中山醫院廈門醫院腎內科，福建廈門 361015

IgA 腎病是全球最常見的原發性腎小球腎炎，是導致終末期腎衰竭的主要原因之一[1]。50%的患者在診斷后25 年內進展為終末期腎病，給家庭和社會帶來沉重的負擔[2]。目前仍缺乏特異性和有效的治療策略。腎炎康復片已成為治療IgA 腎病的常見中藥制劑，具有益氣養陰、補腎健脾、清解余毒等功效[3]，但腎炎康復片治療IgA 腎病的機制尚未明確。本研究基于網絡藥理學探討腎炎康復片治療IgA 腎病的信號通路和作用靶點，通過分子對接分析驗證，為腎炎康復片治療IgA 腎病提供新證據。

1 材料與方法

1.1 腎炎康復片活性成分獲取及其基因靶點預測

檢索中藥數據庫TCMSP（https://www.tcmsp-e.com/tcmsp.php）和TCM-ID（https://bidd.group/TCMID/index.html），以同時滿足口服吸收率≥30%和類藥性≥0.18 為條件對腎炎康復片的活性成分及其對應的靶點信息進行檢索，進一步使用Swiss Target Prediction（http://swisstargetprediction.ch/）擴大檢索，篩選Probability ≥0.2 的靶基因。使用UniProt數據庫規范統一基因靶點名稱格式。

1.2 IgA腎病靶基因獲取

以“IgA nephropathy”為檢索關鍵詞，通過GeneCards（https://www.genecards.org/）、Disgenet（https://www.disgenet.org/）和OMIM（https://omim.org/）數據庫，檢索IgA 腎病相關人類基因，GeneCards 和Disgenet篩選條件分別設置為Relevancescored ≥1.0、Score ≥0.1，將以上3 個數據庫獲得的基因合并匯總并去除重復基因。

1.3 獲取藥物-疾病共同靶點基因

應用Venny 2.1.0 線上作圖平臺（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）對腎炎康復片活性成分靶點基因與IgA 腎病相關人類基因進行交集，篩選出共同靶點。

1.4 構建蛋白質-蛋白質互作（protein-protein interactions，PPI）網絡圖

將1.3 獲得的藥物疾病共同基因導入STRING（https://string-db.org/）數據庫中，條件物種設置為“homosapiens”，相互作用閾值設置為最高置信度（highestconfidence）0.9，使用CytoScape 3.9.1 軟件作靶點間網絡分析，進行可視化處理。

1.5 構建“藥物-活性成分-共同靶點”網絡圖

使用CytoScape 3.9.1 軟件對腎炎康復片-活性成分-靶點網絡作可視化展示，選取自由度（Degree）排名前十的藥物成分為主要活性成分。

1.6 基因本體（gene ontology，GO）與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析

將共同靶點導入Metascape（https://metascape.org/）網絡在線平臺，條件物種設置為“homosapiens”，獲得生物學過程（biologicalprocess，BP）、細胞組成（cellularcomponent，CC）、分子功能（molecularfunction，MF）及KEGG 富集數據，剔除無關信號通路，利用bioinformatics 在線平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/）作可視化展示。

1.7 構建“主要活性成分-靶點-信號通路”網絡圖

使用CytoScape 3.9.1 軟件構建主要活性成分-靶點-信號通路網絡圖，分別選取Degree 值排名前五的藥物成分和基因靶點，推測為腎炎康復片治療IgA 腎病的關鍵成分和核心靶點。

1.8 關鍵成分與核心靶點的分子對接

分別從PuChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和PDB（https://www.rcsb.org/）數據庫下載有效成分化合物結構和核靶點的蛋白分子結構，使用Pymol 軟件去除水分子和小分子配體。經MGLTools-1.5.7 添加極性氫和電荷后作為受體，以有效成分化合物作為配體，運用AutoDock Vina 1.1.2 軟件進行對接，選取結合能較小的構象為最優構象，使用Pymol 作可視化展示。

2 結果

2.1 腎炎康復片和IgA腎病主要靶點篩選結果

通過檢索腎炎康復片化學成分，去除重復值，共有182 個活性成分，對其中TCMSP 數據庫中17 個活性成分缺失的靶點信息使用Swiss Target Prediction 擴大檢索，去除重復值后，得到310 個藥物作用靶點。三個疾病數據庫合并去除重復項后最終得到與IgA 腎病并聯最強的1190 個靶點基因。繪制韋恩圖，獲得共有靶點119 個（圖1）。

圖1 腎炎康復片治療IgA 腎病的藥物-疾病共同靶點韋恩圖

2.2 PPI網絡和藥物-活性成分-靶點網絡

將119 個交集基因導入STRING 數據庫，獲得的數據運用CytoScape 繪制PPI 網絡圖（圖2）和“藥物-活性成分-共同靶點”網絡圖（圖3），藥物及活性成分用縮寫作為標注，共有活性成分用字母A ～G 作為標注，篩選出Degree 值排名前十的主要活性成分為槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、豆甾醇、丹參酮IIA、柚皮素、花生四烯酸、金合歡素、異鼠李素（表1)。

表1 腎炎康復片中Degree值排名前10的主要活性成分

圖2 腎炎康復片治療IgA 腎病PPI 網絡圖

圖3 腎炎康復片與IgA 腎病藥物-活性成分-共同靶點網絡圖

2.3 GO功能分析和KEEG信號通路富集

將119 個基因進行BP、CC 和MF 富集，BP 排名前三的條目為細胞遷移正性調控、對脂多糖的反應、細胞運動的正調節，CC 排名前三的條目為膜筏、膜微區、囊泡腔，MF 排名前三的條目為細胞因子受體結合、細胞因子活性、DNA 結合轉錄因子結合（圖4）。KEEG 信號通路富集結果顯示腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase，PI3K/Akt）信號通路、白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）信號通路、細胞衰老、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路排名靠前（圖5）。

圖4 腎炎康復片治療IgA 腎病的潛在作用靶點的GO 分析

2.4 主要活性成分-靶點-信號通路網絡

結合KEEG 信號通路富集結果，選取2.2 中10種主要活性成分，運用CytoScape 繪制主要活性成分-靶點-信號通路網絡（圖6）。Degree 值排名前五的主要活性成分為槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、豆甾醇，Degree 值排名前五的靶點基因為B 細胞淋巴瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2 gene，BCL2）、前列腺素過氧化物合酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTSG2）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、胱天蛋白酶3（caspase3，CASP3）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase，AKT1），推測為腎炎康復片治療IgA 腎病的關鍵成分和核心靶點。

2.5 分子對接結果

選取Degree 值排名前五的主要成分化合物和核心靶點進行對接（表2）。槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、豆甾醇與核心靶點的結合能大部分都＜-5 kcal/mol，與核心靶點具有較高結合能力。其中豆甾醇與BCL2 和MAPK1、β-谷甾醇與MAPK1和CASP3 結合最優（結合能均＜-7 kcal/mol），對上述4 對分子對接構象作可視化展示（圖7）。

表2 關鍵成分和核心靶點對接結合能以及氫鍵個數

圖7 腎炎康復片關鍵成分和核心靶點分子對接構象圖示意圖

3 討論

中醫將IgA 腎病歸于“腎風、尿血、尿濁、水腫、腰痛、虛勞”等范疇[4]。腎炎康復片的中藥配伍遵循“益氣養陰、補腎健脾、清解余毒”[5]，是治療IgA 腎病的中醫學理論基礎。本研究借助網絡藥理學和分子對接方法探討腎炎康復片治療IgA 腎病機制。

分析獲得腎炎康復片與IgA 腎病高度相關的119 個交集靶點。通過PPI 功能網，篩選出排名前十的主要活性成分。同時GO 和KEGG 富集顯示腎炎康復片可通過多成分、多靶點、多通路治療IgA 腎病。槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、豆甾醇等是腎炎康復片治療IgA 腎病的主要活性成分。槲皮素具有抗氧化、抗炎等作用[6]，可抑制腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1beta，IL-1β）等促炎因子的表達，調控哺乳動物雷帕霉素靶點（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路改善腎臟炎癥損傷及腎間質纖維化[7]。β-谷甾醇具有抗氧化作用[8]。木犀草素可抑制腎小球基底膜增生[9]。山柰酚可減輕內皮細胞氧化應激和凋亡[10]。豆甾醇可發揮抗炎作用[11]。KEGG 富集結果顯示涉及TNF、PI3K/Akt、IL-17、MAPK、細胞衰老等信號通路。結合KEFG 信號通路富集結果及腎炎康復片治療IgA 腎病的主要活性成分進一步拓撲分析得到關鍵靶基因為BCL2、PTSG2、MAPK1、CASP3、AKT1，推測為腎炎康復片治療IgA 腎病的核心靶點。BCL2 是可抑制細胞凋亡[12]。PTSG2 可被TNF-α、IL-1β 誘導引發炎癥反應[13]。MAPK 是促進纖維化的重要信號通路[14]。CASP3 編碼的Caspase-3 在急性腎損傷中發揮重要作用[15]。AKT1 通過調控細胞凋亡及自噬，參與IgA 腎病的調控[16]。將關鍵靶基因與腎炎康復片治療IgA 腎病的藥物活性成分進行分子對接均具有良好的結合能力。

綜上所述，腎炎康復片可能通過槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、豆甾醇等多種成分，作用于BCL2、PTSG2、MAPK1、CASP3、AKT1，調控TNF、 PI3K-Akt、IL-17、細胞衰老和MAPK 等信號通路，調節炎癥反應、細胞凋亡、自噬等途徑，延緩IgA 腎病進展。