補肺填精方對大鼠薄型子宮內膜容受性的實驗研究

張秋梅, 顧仁艷, 張小英, 宋國宏

(新疆醫科大學第五附屬醫院中醫科, 烏魯木齊 830011)

胚胎著床成功的重要因素包括子宮內膜容受性和優質的胚胎[1]。人類輔助生殖技術(Assisted Reproductive Technology,ART)可得到優質胚胎,但只有20%～30%的種植率,說明對妊娠結局產生重要影響的因素為子宮內膜的容受性[2]。子宮內膜容受性(Endometrial receptivity,ER)是指子宮內膜對胚胎的接納能力[3]。決定體外受精胚胎移植術成功與否的兩項重要因素為ER和胚胎質量[4]。研究表明,中藥復方能夠通過調控子宮內膜的形態結構,介導ER相關基因及因子的表達,從而對ER進行改善[5]。 本研究以肺腎陰虛薄型子宮內膜大鼠模型為研究對象,應用補肺填精方,對比常規西藥治療,分析補肺填精方對肺腎陰虛薄型子宮內膜大鼠模型的子宮形態、子宮內膜纖維化、環腺苷酸(Cyclic adenosine monophosphate,cAMP)、環磷酸鳥苷(Cyclic guanosine monophosphate,cGMP)及人同源框蛋白A10 (Homeobox A10,HOXA10)、miR-135a的影響,為自然周期或輔助生殖技術周期中的薄型子宮內膜患者的中醫治療提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物來源 選取未交配10周齡SD雌性大鼠,由湖北省實驗動物研究中心提供[動物許可證號:SCXK(鄂)2020-0018],飼養于新疆醫科大學動物實驗室,體重180～220g。飼養條件[動物適應環境 7 d,自由飲水飲食,室溫(22±1)℃,濕度(40±10)%,光照周期 12 h/12 h]。適應性喂養7 d后,連續陰道涂片HE染色10 d ,篩選40只動情周期規則的大鼠,造模過程中死亡4只。本動物實驗通過新疆醫科大學動物中心動物倫理委員會批準(審批號:IACUC-20210202-11)。

1.1.2 藥物與儀器 補肺填精方(當歸10 g、白芍10 g、熟地黃10 g 、南沙參10 g、北沙參10 g、天冬、麥冬各10 g 等),由新疆醫科大學第五附屬醫院中藥房提供(批號分別為221201、223221201、C177230801、2212361111/220701、C060230401、23062201等),戊酸雌二醇片(J20080036)。病理切片機(廠家:德國Leica公司;型號:RM 2016輪轉式切片機)、環磷酸鳥苷(cGMP)酶聯免疫吸附測定試劑盒(廠家:伊萊瑞特;貨號:E-EL-0083c)、環磷酸腺苷(cAMP)酶聯免疫吸附測定試劑盒(廠家:伊萊瑞特;貨號:E-EL-0056c)、酶標儀(廠家:賽默飛世爾科技公司;型號:mμl ISKANMK3)、微量移液器(廠家:賽默飛世爾科技公司)、低速離心機(廠家:Eppendorf;型號:5702R)

1.2 建立模型隨機選取6只雌性大鼠作為正常對照組,其他34只雌性SD大鼠建立肺腎陰虛模型,采用煙熏+灌胃甲狀腺素造模,30 mg/kg甲狀腺素混懸液灌胃,灌胃10 d后,每天煙熏30 min,連續造模33 d。觀察模型大鼠體質量降低、有嗆咳、少食、易怒等癥狀體征的出現,同時cAMP水平升高,cGMP水平降低,表明大鼠肺腎陰虛造模成功[6]。隨機選取6只作為肺腎陰虛組,其他28只造模成功的大鼠采用宮腔注射95% 無水乙醇法再次建立薄型子宮內膜大鼠模型,觀察形態學特點以評估造模情況[7]。

1.3 分組二次造模過程中死亡4只,其他24只雌性SD大鼠隨機分為陰虛+薄型組、中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組,每組6只。陰虛+薄型組(不予藥物治療)。中藥低劑量組(13.65 g·kg-1·d-1,灌胃30 d)、中藥高劑量組(27.3 g·kg-1·d-1,灌胃30 d)、西藥組(戊酸雌二醇片0.11 mg·kg-1·d-1,灌胃30 d )。

1.4 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察子宮組織病理情況應用4%多聚甲醛磷酸緩沖液對子宮組織標本進行固定,然后進行石蠟包埋、切片操作,經HE染色后在顯微鏡下對子宮組織病理變化進行觀察。

1.5 Masson染色檢測子宮內膜纖維化子宮組織標本固定、石蠟包埋、切片操作同上。經 Weigert鐵蘇木精染液染核、1%鹽酸酒精分化、麗春紅酸性品紅染液染色、1%磷鉬酸溶液分化、苯胺藍染液復染、1%冰醋酸沖洗、95%酒精脫水、無水乙醇脫水、二甲苯透明、風干后中性樹膠封片,鏡檢。

1.6 酶聯免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測cAMP、cGMP水平需平衡至室溫后充分混勻,設空白孔、標準孔和待測樣品孔。酶標板加樣品、標準品和生物素化抗體工作液,加膜37℃孵育,洗板后加酶結合物工作液,再洗板、加顯色劑避光孵育,最后加終止液并用酶標儀測各孔吸光度,并根據標準曲線計算各組cAMP和cGMP的含量。

1.7 實時熒光定量PCR檢測miRNA135a、HOXA10的mRNA相對表達水平通過DNAMAN 軟件設計miRNA135a、HOXA10、U6和GAPDH熒光實時定量PCR引物。逆轉錄cDNA,經過qPCR反應,配制成20ul體系混合均勻,95℃,10 min,95℃,15 s,60℃ 60 s,95℃15s , 40個循環。從而獲得qPCR反應結果,采用2-△△Ct方法用于結果量化計算。

2 結果

2.1 各組大鼠子宮內膜組織形態學變化正常對照組:子宮內膜呈波浪形,腺上皮細胞及腔上皮細胞形態正常,呈單層立方狀,間質無水腫,血管及腺體數量較多;肺腎陰虛組:較正常對照組子宮內膜略有變薄,腺體數量減少;陰虛+薄型子宮內膜組:子宮壁全層均變薄,子宮內膜層較肌層更明顯,內膜組織中血管和腺體稀疏;中藥低劑量組:子宮內膜結構欠完整,腺上皮及腔上皮細胞呈矮柱狀,腺體減少,毛細血管增多,內膜稍厚;中藥高劑量組:子宮腔結構完整內膜比例增加,內膜連續呈波浪形,大部分腺上皮和腔上皮細胞完整,排列整齊,腺體和毛細血管增多;西藥組:子宮腔結構不完整,內膜不連續,腺上皮和腔上皮細胞完整度較差,腺體和毛細血管增多,見圖1。

正常對照組 肺腎陰虛組 陰虛+薄型組

中藥低劑量組 中藥高劑量組 西藥組

2.2 各組大鼠子宮內膜纖維化比較與正常對照組大鼠比較,肺腎陰虛組纖維化程度及子宮組織中的不可溶性膠原纖維含量有所升高;與肺腎陰虛組大鼠比較,陰虛+薄型組中的纖維化程度及子宮組織中的不可溶性膠原纖維含量升高;在藥物治療后,纖維化程度及子宮組織中的不可溶性膠原纖維含量降低。中藥高劑量組的治療效果顯著優于其余各組,見圖2。

正常對照組 肺腎陰虛組 陰虛+薄型組

2.3 各組大鼠cAMP、cGMP 水平比較與正常對照組比較,中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組中的cAMP水平顯著升高;與肺腎陰虛組比較,中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組cAMP水平顯著升高;與陰虛+薄型組比較,中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組cAMP水平顯著降低(P均<0.05),見圖3A、表1。與正常對照組比較,中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組中的cGMP水平顯著降低;與肺腎陰虛組比較,中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組cGMP水平顯著降低;與陰虛+薄型組比較,中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組cGMP水平顯著升高(P均<0.05),見圖3B、表1。此外,各組大鼠質量變化,見表2。

表1 各組大鼠

表2 各組大鼠體質量變化

注：與正常對照組比較, *P<0.05; 與肺腎陰虛組比較, #P<0.05; 與陰虛+薄型組比較, △P<0.05; 表示與中藥低劑量組比較, □P<0.05; 表示與中藥高劑量組比較, OP<0.05。

2.4 各組大鼠miRNA135a、HOXA10的mRNA表達水平比較與正常對照組比較,中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組中HOXA10水平顯著降低(P<0.05)。與肺腎陰虛組比較,中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組的HOXA10水平顯著降低(P<0.05)。與陰虛+薄型組比較,中藥高劑量組和西藥組中的HOXA10的含量顯著升高(P<0.05),見圖4A、表3;與正常對照組、肺腎陰虛組比較,中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組中miR-135a水平均顯著升高。與肺腎陰虛+薄型子宮內膜大鼠組比較,中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組中miR-135a水平顯著下降(均P<0.05),見圖4B、表3。

表3 各組大鼠miRNA135a、HOXA10的mRNA表達水平比較

注： A, HOXA10的mRNA數據分析圖; B, miR-135a的mRNA數據分析圖。 與正常對照組比較, *P<0.05; 與肺腎陰虛組比較, #P<0.05; 與陰虛+薄型組比較, △P<0.05; 與中藥低劑量組比較, □P<0.05; 與中藥高劑量組比較, OP<0.05。

3 討論

腎藏精,主生殖,子宮內膜容受性低下病位在腎,且多與肺、肝、脾相關,病性常為虛實夾雜。多數醫家認為其主要病機為腎氣不足,胞脈不暢,證多屬于腎虛血瘀[8]。腎虛為本、腎脾虧虛是導致子宮內膜容受性差的因素[9]。肺乃嬌臟,且為水之上源,因此治療腎陰虛損時,應養肺潤燥,促金生水。補肺填精方同時滋補肺腎二陰,從而達到金水相生,發揮養陰清肺、補腎養血、益氣健脾之功效,藥物組成:當歸:補血活血、調和經血;白芍:養血調經、平肝止痛;熟地黃:補血填精;南沙參:養陰清肺、益胃生津、益氣;北沙參:益胃生津,既能養肺胃之陰,也能清肺胃之熱;天冬:滋陰潤燥,清肺降火;麥冬:養陰生津、潤肺清心,共同達到補腎潤肺填陰之功效。本研究結果表明,補肺填精方能夠通過改善子宮內膜形態,影響cAMP、cGMP以及miRNA135a、HOXA10的mRNA表達,從而提升大鼠薄型子宮內膜容受性。

子宮內膜厚度是子宮自身功能狀況的一種體現,內膜達到一定厚度是受精卵順利著床的前提。子宮內膜厚度可作為內膜容受性的臨床檢測指標之一[10]。有研究表明,應用補腎中藥對薄型子宮內膜大鼠進行治療后,大鼠的子宮內膜厚度明顯增加,妊娠率顯著提升[11]。本研究結果顯示,與正常對照組比較,其余各組大鼠的子宮內膜厚度較薄,腺體較少,內膜連續性較差。中藥高劑量組中大鼠內膜更加完整,多數腺上皮、腔上皮細胞排列較整齊,腺體和毛細血管數量也有所增加。提示補肺填精方通過促進陰虛+薄型子宮內膜大鼠的子宮內膜修復,提高其子宮內膜厚度及完整性,從而使ER得以提高。

子宮內膜的發育是一個周期性事件,受到激素和生長因子的嚴格調控[12]。“陰虛則熱,陽虛則寒”。現代研究表明,機體寒熱狀態的產生與環核苷酸動態水平變化密切相關[13]。環核苷酸中,cAMP和cGMP為細胞內第二信使,對于細胞活動具有重要調節作用[14]。cAMP和cGMP在動態平衡中維持著機體穩態[15]。有研究證實,中醫辨證陽虛者,cAMP/cGMP比值明顯降低,陰虛者體內cAMP水平升高[16]。本研究結果提示,在補肺填精方干預后,大鼠肺腎陰虛癥狀得以緩解,補肺填精方可以通過促進cGMP的表達,抑制cAMP的表達,最終達到滋陰清熱之功效。

HOXA-10基因是一種同源框轉錄調節因子,在子宮內膜上的腺細胞和基質細胞中高度表達[20-21]。 本研究結果顯示,與正常對照組比較,中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組中HOXA10水平顯著降低。與肺腎陰虛組比較,中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組的HOXA10水平顯著降低。與陰虛+薄型組比較,中藥高劑量組和西藥組中的HOXA10的含量顯著升高;與正常對照組、肺腎陰虛組比較,中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組中miR-135a水平均顯著升高。提示,補肺填精方治療可以通過上調HOXA10,抑制miR-135a的表達,從而改善子宮內膜容受性。分析原因可能為HOXA10通過誘導其下游基因的激活或抑制發揮作用,調節整合素β3、前列腺素系統、刺激基質細胞增生、調節免疫、調節P57、EMX2基因等多個環節,以發揮調節子宮內膜容受性的作用。miRNAs通過多種途徑在轉錄后調節各種靶基因的表達來促進或減弱子宮內膜容受性,影響著胚胎黏附、植入、子宮內膜蛻膜化等多種與子宮內膜容受性緊密相關的重要的生命活動過程。補肺填精方以中醫 “金水相生”、“肺為水之上源” 傳統理論為基礎,以“金水、腎水互相滋生”理念為指導原則,強調肺腎同治,即在中藥滋陰奠基方基礎上添加南北沙參、天麥冬等補肺養陰類中藥材,從而促進患者癸水填充及子宮內膜的生長。

綜上,采用補肺填精方治療薄型子宮內膜大鼠模型,能有效改善其子宮內膜容受性,值得臨床推廣運用。