miR-3680-3p在腎透明細胞癌組織中的表達及與術后復發轉移的關系

茍 東, 王 全, 劉 蓉, 何星成, 龍家才

(巴中市中心醫院泌尿外科, 四川 巴中 636000)

腎細胞癌屬于泌尿系統惡性腫瘤,發生率占成人全部惡性腫瘤的3%～5%,腎透明細胞癌(kidney renal clear cell carcinoma,KIRC)占腎細胞癌的70%,是最常見的腎細胞癌類型之一[1-2]。有研究統計,約30%的腎癌患者在初次診療時已發生惡性轉移,經手術治療后仍有20%～40%的復發轉移風險,預后較差[3]。因此尋找能有效判斷腫瘤預后的生物標志物,對改善患者預后有重要意義。研究發現,腫瘤基因組學和微環境之間的相互作用在癌癥的發生發展中有重要作用[3],KIRC的轉移和侵襲受到miRNAs的影響[4]。微小核糖核酸-3680-3p(miR-3680-3p)是新近發現的miRANs,被證實在人腎癌組織中低表達,在體外細胞學水平上證實低表達狀態的miR-3680-3p能影響人腎癌細胞的生物學行為[5]。本研究通過初步篩選和鑒定KIRC組織中miR-3680-3p是否為其差異表達miRNA,進一步分析miR-3680-3p在KIRC組織中的表達水平及與臨床病理特征及術后復發轉移的關系,以期為臨床KIRC的診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料納入2015年8月至2018年8月在巴中市中心醫院實施手術治療的KIRC患者。納入標準:(1)患者年齡≥18歲;(2)KIRC診斷參照《中國腎癌診治指南:2015版》中對腎細胞癌的診斷標準[6],且經病理檢查確定為KIRC;(3)術前未接受放化療、生物免疫等治療;(4)患者術后可配合長期隨訪。排除標準:(1)伴有其他原發性惡性腫瘤者;(2)合并全身急慢性炎癥反應及免疫疾病者;(3)妊娠期、哺乳期女性。最終選擇符合納入和排除標準的KIRC患者212例。納入研究者對本次研究內容均知情同意并簽署同意書。本研究經醫院倫理委員會審核批準(1932)。

1.2 方法

1.2.1 差異mRNA篩選 隨機選取3例患者的腎癌組織及癌旁組織標本冰上研磨后,加入TRIzol和氯仿,3 000 r/min低溫離心10 min,獲取上清液,以生物分光光度計檢測RNA樣本濃度。經離心過濾器分離miRNA,HiSeq測序獲取干凈序列,使用Gene Pix 4000B基因芯片分析儀(美國AXON公司)及配套數據軟件篩選差異表達miRNA。與癌旁組織比較,癌組織中miRNA表達量≥1.5倍定義為上調,否則為下調。

1.2.2 實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)進行差異表達miRAN驗證 構建20 μL qRT-PCR反應體系加入PCR儀,擴增,進行預變性、變性、退火和延伸(條件:95℃/3 min,95℃/5 s,60℃/30 s、72℃/30 s),共40個循環,以U6為內參,引物序列:上游:5′-CTTCGGAGCACATATACTAA-3′,下游:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGA-3′,2-△△Ct法計算差異表達miRNA的相對表達量。

1.2.3 復發轉移判斷[7]出院后隨訪至2022年8月,前6個月需每隔3個月隨訪1次,之后6個月隨訪1次,每次隨訪進行血堿性磷酸酶檢查,若出現堿性磷酸酶異常或骨痛癥狀,則進一步行影像學檢查判斷是否發生轉移、復發,統計患者的無進展生存結果及總生存結果。將發生轉移、復發或死亡患者納入發生組,其余則納入未發生組。

1.2.4 臨床病理特征收集 收集患者的資料,包括性別、年齡、體質指數(body mass index,BMI),是否吸煙、飲酒,是否合并高血壓、糖尿病,根據MRI或CT檢查明確病灶直徑及部位,根據手術及病理結果明確TNM分期、Fuhrman分級、有無腎被膜浸潤、囊性腎癌、腫瘤壞死、有無淋巴結轉移,記錄手術方式。

1.3 觀察指標(1)對比癌組織與癌旁組織的miR-3680-3p水平;(2)統計隨訪結果,以癌組織miR-3680-3p表達水平的中位數為分界分為高表達組和低表達組,比較兩組的miR-3680-3p水平;(3)分析miR-3680-3p表達與病理學參數的關系;(4)Kaplan-Meier(K-M)生存分析miR-3680-3p低表達組和高表達組的無進展生存期和總生存期差異;(5)Cox比例風險回歸分析影響KIRC患者復發轉移的因素。

2 結果

2.1 KIRC組織中的差異miRNA表達分析對miRNA表達譜進行處理和分析,得到8個具有代表性的差異表達miRNA,其中3個表達上調,5個表達下調,下調表達miRNA中miR-3680-3p最為明顯,見表1。

表1 KIRC組織中8個差異表達miRNA

2.2 癌組織與癌旁組織miR-3680-3p水平比較癌組織miR-3680-3p表達量為(1.25±0.34),低于癌旁組織的(3.20±0.80),差異有統計學意義(t=23.096,P=0.000)。

2.3 miR-3680-3p表達量與不同病理學參數的關系以miR-3680-3p表達的中位數1.25為分界,將患者分為低表達組(n=106)和高表達組(n=106),miR-3680-3p低表達組患者的年齡≥60歲、囊性腎癌、腎被膜浸潤及手術根治性切除占比、發病部位與高表達組患者比較,差異無統計學意義(P>0.05),miR-3680-3p高表達組患者的腫瘤直徑(>10 cm)、腫瘤壞死、TNM分期(Ⅲ～Ⅳ期)、Fuhrman分級(3～4級)占比、有淋巴轉移占比低于低表達組,差異有統計學意義(P<0.05),見表2。

表2 miR-3680-3p與不同病理學參數的關系

2.4 miR-3680-3p表達不同患者的預后結果患者隨訪24～60個月,K-M分析顯示,低表達組和高表達組的無進展生存期分別為45.36(43.65～53.65)個月、50.25(47.63～60.03)個月,總生存期時間分別為53.2(50.48～55.58)個月、59.57(58.83～60.31)個月,兩組無進展生存期和總生存期的K-M曲線比較,差異有統計學意義(LogRankχ2=4.676、5.794,P=0.031、0.016),見圖1。

無進展生存K-M曲線 總生存曲線

2.5 影響KIRC患者復發轉移的Cox比例風險回歸分析將發生術后復發轉移設置為因變量(發生=1,未發生=0),將患者的一般資料作為自變量,數據錄入SPSS26.0軟件進行多因素Cox比例風險回歸分析,結果顯示,TNM分期(Ⅲ～Ⅳ期)、Fuhrman分級(3～4級)及miR-3680-3p低表達是影響患者術后復發轉移的獨立風險因素(P<0.05),見表3。

表3 影響KIRC患者復發轉移的Cox比例風險回歸分析結果

3 討論

腎癌患者在發病早期并無特異性的癥狀,且臨床癥狀復雜、多變。出現血尿、腹部包塊及腰痛等典型的三聯征時多數已達到中晚期,預后較差[8]。腎癌對放化療不敏感,手術是其最佳治療方案,但手術過程中不可避免會對腫瘤造成擠壓,可能造成癌細胞進入外周血,使術后的復發及轉移風險大大增加[9]。臨床中常用血清腫瘤標志物對預后進行預測,但準確度較低,臨床中缺乏科學有效的早期預測指標,因此需尋求有效的生物學標志物以輔助判斷,制定個性化的治療方案。

本研究顯示,經基因芯片技術及qRT-PCR篩選出KIRC組織中miR-3680-3p有顯著的差異表達,并驗證了癌組織中的miR-3680-3p表達量低于癌旁組織。miR-3680-3p高表達組患者的腫瘤直徑(>10 cm)、腫瘤壞死、TNM分期(Ⅲ～Ⅳ期)、Fuhrman分級(3～4級)占比、有淋巴轉移占比低于低表達組,說明miR-3680-3p在KIRC中表達量下降,且其表達水平與病理分級有一定的關系。miR-3680-3p作為小分子單鏈RNA,能夠在轉錄水平發揮基因調節作用,與基因mRNA的3′非編碼區結合,影響靶基因mRNA的降解及翻譯,在細胞的生長、凋亡、增殖、遷移中發揮調控作用[10-11]。在癌癥的發生發展過程中,癌細胞的增殖、遷移等會影響腫瘤的生長、分期、分級等情況,因此可推測miR-3680-3p能夠影響KIRC的發展。Shi等[12]研究發現,miR-3680-3p為環狀RNA-蛋白激酶C的海綿分子,能上調蛋白激酶B,刺激食管鱗狀細胞癌的遷移和增殖。由此可知,miR-3680-3p的低表達與KIRC的發生發展有關,其機制尚待進一步研究明確。

miRNA在癌癥中的過表達和低表達均可影響腫瘤的遷移和侵襲能力,是導致患者預后不佳的重要因素。因此,異常表達的miRNA具有作為癌癥診斷、預后預測的生物學標志物和治療靶點的研究價值[13-14]。本研究通過K-M分析顯示,miR-3680-3p高表達組和低表達組的無進展生存和總生存時間存在差異,Cox比例風險回歸分析證實miR-3680-3p低表達為影響患者術后復發轉移的獨立風險因素,說明miR-3680-3p可作為KIRC患者的預后預測生物標志物。miR-3680-3p是新近發現的mRNA,其定位的染色體尚不明確。但王斌等[5]通過生物信息學軟件發現其在人腎癌組織中異常表達,且為調控血管細胞生長因子C的靶基因,體外細胞實驗驗證了過表達的miR-3680-3p能夠抑制人腎癌細胞的遷移和增殖。故可推測miR-3680-3p的低表達可能通過上調蛋白激酶B,抑制人腎癌細胞的凋亡,促進其增殖和遷移,導致KIRC的復發。因此臨床可考慮將miR-3680-3p作為KIRC預后預測的生物標志物或靶向治療研究方向。

綜上所述,KIRC組織中miR-3680-3p表達量下降,且miR-3680-3p低表達為影響患者術后復發轉移的獨立危險因素,可作為KIRC預后預測生物標志物。但腫瘤患者預后受遺傳、環境等多因素影響,機制較為復雜,后續仍需進行體外轉錄實驗,進一步明確miR-3680-3p對腎癌細胞的調控機制。