阿爾茲海默癥患者外周血miR-19b-3p和PTEN的表達及臨床意義

哈尼克孜·阿不都熱依木, 王 燕, 努爾比亞·米爾扎木, 阿力木江·亞森

(1新疆醫科大學第一附屬醫院健康管理中心, 烏魯木齊 830054; 2新疆維吾爾自治區第四人民醫院重癥醫學科, 烏魯木齊 830000)

阿爾茲海默癥(Alzheimer′s disease,AD)是一種是持續性神經功能障礙,臨床表現為記憶障礙、認知障礙等[1]。隨著AD病情的發展,患者逐漸失去生活自理能力,嚴重者會出現幻覺、妄想等癥狀,影響患者身心健康,給家庭帶來沉重的負擔[2-3]。因此及時評估AD病情,制定有效的干預方案對于AD患者具有重要意義。磷酸酶及張力蛋白同源物(Phosphate and tension homology,PTEN)是目前公認的抑癌因子,PTEN編碼的蛋白同時具有蛋白磷酸酶和脂質磷酸酶活性,在細胞增殖周期及細胞發育中發揮重要作用。研究發現,PTEN在多種腦損傷中發揮一定的保護作用,能夠改善認知功能,這可能與PTEN加速神經細胞的修復有關[4-5]。微小RNA(microRNA,miRNA)是存在于血液中的游離RNA,在多種疾病的診斷、預后預測中均發揮重要作用[6]。miR-19b-3p是一種具有調控基因表達的非編碼分子,在血清中能夠穩定存在,近年來研究發現,miR-19b-3p與大腦認知功能存在一定的聯系[7]。miR-19b-3p在AD模型細胞及AD患者體內均呈低表達,對于AD的診斷具有一定參考價值[8]。PTEN和miR-19b-3p在AD的發生發展中均起到一定作用,但二者與AD病情嚴重程度是否具有相關性,目前尚無確切定論。本研究通過對不同嚴重程度AD患者的臨床資料進行分析,探究miR-19b-3p、PTEN與AD嚴重程度的關系,以期為AD患者治療方案的制定提供參考,現報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料選取2020年2月-2023年2月期間新疆醫科大學第一附屬醫院健康管理中心和新疆維吾爾自治區第四人民醫院重癥醫學科收治的97例AD患者為AD組,其中男性52例,女性45例,年齡60～85歲,平均年齡(70.85±5.28)歲,BMI為22～25 kg/m2,平均BMI(23.51±1.25)kg/m2;病程0.5～2年,平均病程(1.37±0.28)年;基礎疾病情況:合并糖尿病者39例,合并高血壓者44例,合并高脂血癥49例。選取同期63例體檢健康老年人為對照組,其中男性37例,女性26例,年齡60～85歲,平均年齡(69.63±4.86)歲,BMI為22～25 kg/m2,平均BMI(23.05±1.62) kg/m2。AD組與對照組一般資料(性別、年齡、BMI)比較,差異無統計學意義(P>0.05)。AD組納入標準:(1)參照《中國癡呆與認知障礙診治指南》[8],患者均確診為AD;(2)患者年齡>60歲;(3)患者飲食正常;(4)簡易精神狀態(MMSE)評分>13分;(5)患者均于本院進行治療;(6)患者或其家屬簽署知情同意書。排除標準:(1)患有精神類疾病者;(2)合并其他腦部疾病;(3)近期接受認知功能訓練者;(4)患有心、肺、腎功能障礙者;(5)患有惡性腫瘤者。本研究經新疆醫科大學第一附屬醫院、新疆維吾爾自治區第四人民醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平的檢測 采集對照組與AD組患者入院時的外周血液樣本4 mL,3 000 r/min離心15 min,取上層血清加入Trizol采用miR試劑盒提取血清總RNA,采用分光光度法檢測RNA濃度,根據PCR試劑盒說明書配置反應體系(上下游引物各1 μL,緩沖液5 μL,cDNA2 μL,SYBR 10 μL,純水加至20 μL),以總RNA為模板,按照逆轉錄試劑盒說明書得到cDNA,再以cDNA為模板,參考熒光定量PCR試劑盒說明書進行擴增,反應步驟設置為:95℃ 30 s,95℃ 5 s,56℃ 20 s和 72℃ 30 s,擴增40個循環。使用2-△△CT法計算miR-19b-3p、PTEN mRNA 水平,以U6和β-actin為內參,引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.2 病情程度評估及分組 根據患者入院時的具體情況,綜合總體退化量表(GDS)、日常生活能力量表(ADL)及臨床癡呆評定量表(CDR)評估AD患者入院時的病情程度[10],輕度:患者記憶力受到影響,但生活能夠自理;中度:較為嚴重的記憶障礙,部分患者伴隨括約肌障礙,生活自理能力受到一定影響,需要他人的照顧;重度:智力損傷嚴重,出現明顯的括約肌障礙,失去生活自理能力,完全依賴于他人的照顧。輕度AD患者納入輕度組,中度及重度AD患者納入中重度組。

2 結果

2.1 對照組與AD組血清miR-19b-3p、PTEN mRNA表達水平比較與對照組比較,AD組血清miR-19b-3p、PTEN mRNA表達水平均降低,差異有統計學意義(P<0.05),見表2。

表2 對照組與AD組血清miR-1p、PTEN mRNA表達水平比較

2.2 不同病情程度AD患者臨床資料比較97例AD患者中輕度59例,中重度38例;兩組AD患者的性別、年齡、病程、發病年齡、住院時間、文化程度、合并糖尿病、合并高血壓、合并高脂血癥、腦部疾病史、AD家族史、LDL-C、HDL-C、TG及TC水平比較,差異無統計學意義(P>0.05);中重度組血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平均低于輕度組,差異有統計學意義(P<0.05),見表3。

表3 不同病情嚴重程度AD患者臨床資料比較

2.3 影響AD病情嚴重程度的多因素分析將連續變量病程、血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平及腦部疾病史(有=1,無=0)作為自變量進行賦值,AD患者病情嚴重程度情況(中重度=1,輕度=0)作為因變量進行賦值,經Logistic回歸分析表明,血清miR-19b-3p、PTEN mRNA低水平是影響AD病情嚴重程度的獨立危險因素(P<0.05),見表4。

表4 影響AD患者病情嚴重程度的多因素分析

2.4 血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平與AD嚴重程度的相關性分析經Spearman相關性分析表明,AD患者血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平與AD嚴重程度均呈負相關(r=-0.610,P<0.05;r=-0.870,P<0.05),見圖1、2。

圖1 血清miR-19b-3p水平與AD嚴重程度相關性的散點圖

圖2 血清PTEN mRNA水平與AD嚴重程度相關性的散點圖

2.5 血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平對AD病情嚴重程度的預測價值ROC分析結果表明,血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平及二者聯合評估AD病情嚴重程度的AUC值(95%CI)分別為0.757(0.660～0.839)、0.718(0.617～0.804)、0.861(0.776～0.923),二者聯合預測效能高于各項單獨檢測(Z=2.088、2.618,P<0.05),見表5、圖3。

圖3 血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平單獨及聯合評估AD嚴重程度的ROC曲線圖

表5 血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平對AD病情嚴重程度的預測價值

3 討論

AD的病理位置為大腦皮層、海馬區,病理區域的神經元纖維纏結、神經元損傷或丟失及老年斑的形成導致AD的發生[11]。β淀粉樣蛋白(Amyloid-beta peptide,Aβ)具有一定的神經毒性,能夠引起神經元的凋亡、淀粉樣變及壞死,是老年斑的主要成分,當Aβ代謝異常導致Aβ聚集時,就會造成神經元損傷,引起AD的發生[12]。高度磷酸化的tau蛋白是神經元纖維纏結的重要構成成分,目前認為tau蛋白的過度磷酸化是AD發病機制中的重要環節[13]。因此Aβ與tau蛋白的過度磷酸化是目前AD領域的研究熱點。

PTEN通過多種機制對大腦的發育及功能維持起到重要的調節作用,參與腦缺血等多種腦部疾病的發生與發展[14]。miR-19b-3p在血清中穩定存在,能夠調控基因的表達,近年來研究發現,miR-19b-3p的表達與認知功能有關[15]。本研究對AD患者血清miR-19b-3p、PTEN表達情況進行檢查,結果顯示,AD組血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平均低于對照組,提示miR-19b-3p、PTEN參與AD的病情發展。中重度組血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平均低于輕度,經Logistic回歸分析,血清miR-19b-3p、PTEN mRNA低水平是影響AD病情嚴重程度的獨立危險因素,表明血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平影響AD的病情嚴重程度。分析原因為,PTEN在大腦中廣泛表達,當認知功能出現障礙時,神經元受損,PTEN用于神經系統代償性修復,導致外周血中PTEN mRNA水平降低。線粒體功能障礙是AD的一個顯著特征,基礎研究發現,線粒體功能在Aβ與tau蛋白的過度磷酸化中發揮重要作用[16]。miR-19b-3p能夠調控Aβ與tau蛋白的表達,Aβ與tau蛋白表達減少引起神經元損傷,導致認知功能受損,AD病情進一步發展。PTEN是PI3K/Akt通路的主要負調控因子,Matsuda等[17]研究表明,PI3K/AKT/PTEN通路通過影響tau蛋白過度磷酸化及超氧化物歧化酶的表達,參與AD的發生與發展。PTEN過表達能夠誘導推定激酶1,介導線粒體自噬,增加抗氧化蛋白的表達并減少氧化損傷,對神經元死亡發揮保護作用,逆轉線粒體功能障礙,控制AD大鼠中線粒體的自噬作用[18]。江愛民等[19]研究證實,干擾LncRNA MCM3AP-AS1表達,能夠通過靶向調控miR-19b-3p水平,減輕對氧糖剝奪再復氧誘導的神經元細胞損傷。上述研究與本研究均表明PTEN、miR-19b-3p參與AD病情發展。

Spearman相關性分析表明,AD患者血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平與AD嚴重程度均呈負相關,表明血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平隨著AD病情嚴重程度降低。分析原因為,隨著AD病情的發展,PTEN過量表達加重tau蛋白的過度磷酸化,通過線粒體凋亡促進神經元死亡,表現出以線粒體形態學異常及功能障礙為特征的氧化應激反應,從而引起認知功能異常,加重AD病情[20]。miR-19b-3p在AD病情發展中的作用機制目前尚不明確,有研究表明,miR-19b-3p通過靶向調控SH-SY1Y 細胞中的β-淀粉樣前體蛋白水解酶5,緩解淀粉樣蛋白β誘導的損傷,提示miR-19b-3p可作為AD治療的保護劑[21]。推測miR-19b-3p減少Aβ能夠引起神經元損傷,從而加重AD病情。此外PTEN為miR-19b-3p特意性靶標在細胞的分化調節中有重要作用,但在其是否可靶向調控PTEN影響神經元細胞仍有待進一步的實驗驗證[22]。臨床可根據患者血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平判斷患者病情程度,指導治療方案的制定。為進一步分析血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平與AD病情嚴重程度的關系。本研究進行ROC分析,結果顯示血清miR-19b-3p、PTEN mRNA聯合預測的AUC值高于單獨預測,提示二者聯合能夠提高血清miR-19b-3p、PTEN mRNA單獨預測AD病情嚴重程度的靈敏度及特異度,表明二者聯合對于預測AD病情嚴重程度具有更高的參考價值。臨床可對血清miR-19b-3p表達水平低于0.48,且PTEN mRNA表水平低于0.31的患者予以重點檢查,并及時干預,以延緩病情的發展,改善患者生活質量。

綜上所述,AD患者miR-19b-3p、PTEN 水平異常降低,與AD病情嚴重程度呈負相關,miR-19b-3p聯合PTEN mRNA檢查對于預測AD病情嚴重程度具有較高價值。