基于CSE/H2S體系探討蔥白提取物對H2S催化酶及趨化因子CX3CL1的作用機制

雷 杰, 鄭瓊莉, 段剛峰

(1湖北中醫藥大學中醫臨床學院, 武漢 430000; 2博樂市人民醫院, 新疆 博樂 833400)

據《中國心血管健康與疾病報告2019》提供的數據顯示[1],心血管疾病依然占城鄉居民總死亡原因的首位,包括腫瘤和其他疾病在內。其中冠心病的患病率及死亡率自2012年以來一直呈逐年上升趨勢,15歲及以上人口冠心病患病率為10.2‰,造成了沉重的社會負擔。動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是導致冠心病的重要病理學基礎,其特征是大、中型血管管壁脂質沉積、內膜增厚、斑塊形成。動脈粥樣硬化的形成與發展過程十分復雜,目前尚未完全闡明,主要涉及脂質代謝、炎癥、氧化應激、免疫等多個方面。近年來,硫化氫(H2S)氣體信號分子以其抗氧化應激[2]、抗炎癥[3-4]等效應,在調控動脈粥樣硬化發生發展方面起著重要作用。H2S主要由胱硫醚β合成酶(Cystathionine β synthase,CBS)、胱硫醚γ裂解酶(Cystathionine γ lyase,CSE)、3-巰基丙酮酸硫基轉移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,MST)催化生成。在心血管系統中,H2S在調節血脂含量、抑制泡沫細胞形成、降低基質金屬蛋白酶(MMP)活性、促進內皮細胞增殖和遷移、抑制趨化因子受體CX3CR1和趨化因子配體CX3CL1的表達、抗凝血等方面發揮了重要的作用[5]。而CX3CR1和CX3CL1在AS發展過程中可趨化單核細胞黏附到活化的內皮細胞,激活血小板[6]。本團隊前期研究證實,與空白模型組對比,蔥白提取物可以顯著升高急性心肌缺血大鼠血漿H2S、一氧化氮(NO)水平(P<0.01)[7],還可通過PPAR信號通路降低血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的濃度及基質金屬蛋白酶9(MMP-9)的濃度,減少血管壁脂質沉積[8]。本研究擬進一步探討蔥白提取物能否通過調控內源性H2S水平,抑制CX3CR1、CX3CL1表達,降低MMP活性,從而改善動脈粥樣硬化病變,為動脈粥樣硬化的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物純種健康雄性SD大鼠,SPF級,體重(200±20)g,共40只,由湖北省實驗動物研究中心提供(動物合格證編號:42000600000069)。飼養于武漢市中西醫結合醫院中心實驗室,每籠5只,動物房晝夜12 h光暗變替,室內溫度25℃,濕度60%,飼料與飲水均經輻射消毒并可自行隨意攝取。本研究通過武漢市第一醫院醫學倫理委員會審批(審批號:[2018]8號)。

1.2 實驗試劑蔥白提取物由武漢市中西醫結合醫院制劑中心提供(批號:20170326),配置成最終濃度為0.10 mg/mL的溶液。該提取物是將雙子葉百合科植物分蔥的新鮮鱗莖先經微波干燥,再行超臨界萃取而得,總得率為1.85%左右,其主要成分包括硫化合物、甾體、皂苷、不飽和脂肪酸等。辛伐他汀(舒降之)片由杭州默沙東制藥有限公司提供(批號:02001697),配置成最終濃度為10 mg/mL的溶液。膽固醇、膽酸鈉、維生素D3粉劑和丙基硫氧嘧啶均購自武漢宇陽鋒銳生物科技有限公司(批號分別為:C104028,B13101001,C105354),其余試劑均為市售分析純。

1.3 儀器低溫高速離心機(Sorvall Stratos,賽默飛,美國),超低溫冰箱(MDF-390AT,SANYO,日本),組織包埋機(Leica 公司,德國),組織切片機(Leica 公司,德國),熒光顯微鏡(CX22,OLYMPUS公司,日本),全自動生化分析儀(AU2700,貝克曼公司,美國),多功能酶標儀(SpectraMax iD5,美谷分子儀器有限公司,美國),垂直電泳儀(JY-SCZ,北京六一儀器廠),凝膠圖像分析儀(EBOX CX5,Viber Lourmat 公司,法國)。

1.4 方法

1.4.1 模型制備及分組 40只大鼠適應性喂養1周,隨機選擇10只作為正常組,另外30只參考文獻[9]的方法制備大鼠AS模型,再隨機分為模型組、蔥白提取物組、辛伐他汀組,每組各10只。其中正常組以基礎飼料喂養,模型組、蔥白提取物組、辛伐他汀組均以高脂維生素D3飼料(2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、3%豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.012 5%維生素D3粉劑和85.275%的基礎飼料)喂養。各組飲水為經輻射消毒的普通自來水。在實驗開始時,即用維生素D3針劑(3×105u/kg體質量)在大鼠右下肢行肌肉注射1次,每周1次,連續4周。

1.4.2 給藥方法 從第5周開始,蔥白提取物組大鼠給予配置好的蔥白提取物溶液10 mL/kg體質量灌胃,辛伐他汀組大鼠給予辛伐他汀混懸液10 mL/kg體質量灌胃;正常組和模型組均給予等容積生理鹽水10 mL/kg體質量灌胃,共連續8周。

1.4.3 標本取材與制備 在第12周時,將各組大鼠禁食過夜,每組大鼠均予以3%戊巴比妥腹腔注射麻醉并固定,先從腹主動脈抽血,分離血漿、血清,于-80℃保存,然后插管入升主動脈,用生理鹽水沖洗,分離主動脈。每組取部分主動脈組織于-80℃保存備用(用以RT-PCR和WB檢測),部分大鼠主動脈組織以1%多聚甲醛及1.25%戊二醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液灌洗,取下整段主動脈備用,用以HE染色。

1.4.4 血脂水平檢測 用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、載脂蛋白B(ApoB)的含量。

1.4.5 血管病變程度檢測 將固定好的主動脈標本脫蠟至水,依次予以蘇木素、伊紅染液染色,然后脫水封片,觀察血管病理損傷程度。

1.4.6 H2S催化酶含量的檢測 采用Western blot法檢測大鼠主動脈胱硫醚β合成酶(CBS)和3-巰基丙酮酸硫基轉移酶(3MST)的含量。

1.4.7 主動脈組織趨化因子及MMP基因及蛋白表達的檢測 采用RT-PCR和Western blot方法檢測CX3CL1、CX3CR1、MMP7、MMP9的基因及蛋白表達。

2 結果

2.1 各組大鼠血脂水平比較與正常組比較,模型組大鼠血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、載脂蛋白B濃度均升高(P<0.05),高密度脂蛋白膽固醇濃度降低(P<0.05),提示造模成功。與模型組比較,蔥白提取物組及辛伐他汀組大鼠血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、載脂蛋白B濃度均降低(P<0.05),高密度脂蛋白膽固醇濃度升高(P<0.05),說明蔥白提取物同辛伐他汀一樣,都能有效調節大鼠血清血脂水平,見表1。

表1 蔥白提取物對各組大鼠血脂水平的影響

2.2 病理組織學檢測正常組大鼠主動脈內膜光滑,結構完整,局部無斷裂及缺損,內膜無增厚,管壁無可見斑塊,管腔無狹窄。模型組內膜結構局部斷裂不連續,部分內膜明顯增厚,在內膜局部還可看到大量脂類物質進入內膜下形成的膽固醇結晶及較大斑塊,斑塊纖維帽較薄,管腔可見明顯狹窄。蔥白提取物組及辛伐他汀組內膜亦可觀察到增厚及局部結構破壞,并可在內膜局部觀察到脂類物質沉積形成的粥樣斑塊。與模型組比較,蔥白提取物組及辛伐他汀組斑塊內部的膽固醇結晶較少,管腔狹窄程度較輕,見圖1。

正常組 模型組 蔥白提取物組 辛伐他汀組

2.3 蔥白提取物對各組AS大鼠主動脈CX3CL1、CX3CR1、MMP7、MMP9基因mRNA表達水平的影響與正常組比較,模型組CX3CL1 mRNA、CX3CR1 mRNA、MMP7 mRNA、MMP9 mRNA表達均上調。與模型組比較,蔥白提取物組和辛伐他汀組CX3CL1 mRNA、CX3CR1 mRNA、MMP7 mRNA、MMP9 mRNA表達均下調,見表2。

表2 蔥白提取物對AS大鼠主動脈組織CX3CL1、CX3CR1、MMP7、MMP9基因mRNA表達的影響

2.4 蔥白提取物對大鼠主動脈CBS、3MST、CX3CL1、CX3CR1蛋白表達的影響與正常組比較,模型組大鼠主動脈組織中3MST、CBS蛋白相對表達量降低(P<0.05),而CX3CL1、CX3CR1蛋白相對表達量升高(P<0.05)。與模型組比較,蔥白提取物組和辛伐他汀組大鼠主動脈組織中3MST、CBS蛋白相對表達量升高(P<0.05),而CX3CL1、CX3CR1蛋白相對表達量降低(P<0.05)。蔥白提取物組與辛伐他汀組間比較,差異無統計學意義,見表3、圖2。

圖2 各組大鼠CBS、3MST、CX3CL1、CX3CR1、GADPH蛋白表達水平

表3 蔥白提取物對大鼠主動脈CBS、3MST、CX3CL1、CX3CR1表達的比較

3 討論

動脈粥樣硬化在中醫學中并無與之相對應的病名,以其脂質沉著,痹阻血脈的特點,大致可歸于“胸痹”病范疇?！靶乇浴钡牟∫虿C在《金匱要略》中被概括為:“陽微陰弦”,意為陽氣上虛,陰寒下盛,寒乘虛而往上攻,所以胸痹心痛。根據這一特點,在治療上《金匱要略論著》提出“陽無取乎補,宣而通之”,可見“辛溫通陽”是治療胸痹病的重點所在。蔥屬百合科植物,蔥白為其近根部的鱗莖,味辛性溫,具有發汗解表、通達陽氣的功效[10]。現代藥理學研究亦發現[11],蔥白提取物有調節血脂代謝、抗氧化損傷、抗炎癥反應、抗血小板聚集、促進血管損傷后內皮化等作用。

趨化因子CX3CL1最早由Bazan等[12]發現,它是一種具有可溶型和膜結合型雙重形式的異常趨化因子,可溶型主要起趨化因子的作用,膜結合型主要介導黏附作用。在動脈粥樣硬化過程中,表達CX3CR1的血液單核細胞與表達CX3CL1的血管內皮細胞結合,促進單核細胞和內皮細胞之間的黏附。CX3CL1或CX3CR1基因缺失均可使小鼠產生抗動脈粥樣硬化作用。MMP分為I型膠原酶、明膠酶、基質降解酶、膜型基質金屬蛋白酶、其他基質金屬蛋白酶五大類,能降解細胞外基質,引起炎癥反應、調控炎癥相關因子,參與動脈粥樣硬化全過程[13]。其中,MMP9主要對IV型膠原進行降解,進而損傷血管內皮細胞、促進血管平滑肌細胞遷移和增殖、加劇管壁局部炎癥反應、引發斑塊破裂和血栓形成。MMP7定位于AS斑塊易破裂處,但在正常血管中不易監測到。有研究報道稱,MMP7參與N-鈣黏蛋白的分解,調節血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cells,VSMC)的凋亡,使AS斑塊纖維帽變薄,使得斑塊不穩定,易于破裂[14]。本實驗研究發現,與模型組相比,蔥白提取物組CX3CL1、CX3CR1蛋白相對表達量顯著下降(P<0.05),CX3CL1 mRNA、CX3CR1 mRNA、MMP7 mRNA、MMP9 mRNA表達均下調。說明蔥白提取物通過抑制CX3CL1、CX3CR1、MMP7、MMP9的表達,發揮抗動脈粥樣硬化作用。

自1989年Warenycia等[15]在人腦中首次發現H2S以來,科學家們對這個新型氣體分子展開了廣泛研究。不僅證實內源性H2S具有抗動脈粥樣硬化作用[16],更有研究發現[17],H2S抑制了活化巨噬細胞中CX3CR1的表達,降低了apoE-/-小鼠主動脈中CX3CR1的表達,且H2S誘導CX3CR1表達的降低是通過過氧化物酶體增殖激活物受體c途徑介導的。支持這一觀點的證據是,外源性H2S供體硫氫化鈉(NaHS)劑量依賴性地增加了干擾素c(IFN-c)或炎癥遞質脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7細胞和小鼠腹腔巨噬細胞中PPAR-c的DNA結合活性。CSE過表達也增強IFN-c或LPS刺激RAW264.7細胞中PPAR-c的激活。本研究亦證實,與模型組相比,蔥白提取物組大鼠主動脈組織中生成H2S的催化酶—CBS、3MST蛋白相對表達量明顯升高(P<0.05)。

綜上所述,蔥白提取物可能通過調控內源性H2S生成體系,抑制CX3CL1、CX3CR1表達、降低MMP7、MMP9活性,從而起到抗AS的功效。然而本實驗數據仍然不足以建立H2S抑制動脈粥樣硬化作用與巨噬細胞CX3CR1-CX3CL1表達之間的明確因果關系,進一步的研究可能需要在CX3CR1/CX3CL1基因修飾的大鼠中進行,以探測確切的相關連鎖反應。