不同濃度丙泊酚對人乳腺癌雌激素受體陽性MCF-7細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響

張雪蓉, 萬麗萍, 阿孜古麗·阿吉, 朱 鈞

(1新疆維吾爾自治區(qū)兒童醫(yī)院麻醉科; 2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院麻醉科, 烏魯木齊 830000)

乳腺癌是發(fā)生于乳腺上皮或?qū)Ч苌掀さ膼盒阅[瘤,是全球女性發(fā)病率、轉(zhuǎn)移率、死亡率最高的癌癥[1]。全身麻醉下行乳腺癌根治術(shù)是目前臨床上最主要的治療方式,但仍有部分患者術(shù)后發(fā)生局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致乳腺癌患者術(shù)后生存率降低[2]。丙泊酚是一類鎮(zhèn)靜、催眠藥物[3],是手術(shù)麻醉誘導(dǎo)及維持的主要用藥,具有鎮(zhèn)靜、催眠作用[4],廣泛應(yīng)用于臨床麻醉。研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚在炎癥、感染、腫瘤預(yù)后等方面具有非麻醉作用,與癌癥預(yù)后存在相關(guān)性,但對癌癥預(yù)后的具體影響尚存爭議[5-8]。有學(xué)者認(rèn)為丙泊酚可以降低癌癥細(xì)胞活性,提高術(shù)后生存率[9-10]。也有學(xué)者認(rèn)為丙泊酚能夠激活腫瘤細(xì)胞,促進腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移[11]。不同癌細(xì)胞、不同細(xì)胞受體、不同信號通路都可造成丙泊酚對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的改變[12],但這種行為改變是否會隨著丙泊酚濃度的不同而有所改變尚無定論。目前,對于丙泊酚對腫瘤活性影響的研究多停留在動物實驗或者回顧性研究層面,前瞻性研究仍較少。本研究探究不同濃度丙泊酚對人乳腺癌雌激素受體陽性MCF-7細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力的影響,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)將人乳腺癌雌激素受體陽性MCF-7細(xì)胞(上海雅吉生物科技有限公司)接種到含10%胎牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基(美國Sigma-Aldrich公司)中,于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng),每24 h更換1次培養(yǎng)基,3 d后當(dāng)細(xì)胞生長至70%～80%貼壁時用于后續(xù)實驗。

1.2 細(xì)胞分組將“1.1”項下傳代后的人乳腺癌雌激素受體陽性MCF-7細(xì)胞隨機分為3組,分別置于培養(yǎng)皿中,P0組(加入等量血清)、P25組(加入丙泊酚 25 μg/mL,西安立邦有限公司,批號:12020042541)、P50組(加入丙泊酚50 μg/mL),孵育72 h后,備用。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 細(xì)胞增殖實驗 將“1.2”項下3組細(xì)胞分別接種在12孔板內(nèi),每孔500個,置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d,用90%乙醇固定,用0.1%結(jié)晶紫進行細(xì)胞染色,顯微鏡放大200倍下觀察并拍照,計算細(xì)胞克隆數(shù)量。

1.3.2 細(xì)胞遷移及侵襲實驗 遷移實驗:在Transwell上室內(nèi)加入Matrigel膠,將Matrigel膠均勻的鋪在Transwell上室底部,直到其凝固成膠凍樣。挑選呈對數(shù)生長的人乳腺癌雌激素受體陽性MCF-7細(xì)胞,經(jīng)胰酶消化細(xì)胞后用PBS等滲液沖洗,接種于無血清的培養(yǎng)基中,調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為2.5×105個/100 μL,將“1.2”項下3組細(xì)胞分別接種在Transwell上室,下室加入含10%胎牛血清600 μL的RPIM1640培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h。將Transewll小室放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)5 h,先將小室內(nèi)部的細(xì)胞用棉簽擦拭,然后用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞15 min,用結(jié)晶紫進行染色。顯微鏡放大200倍下觀察細(xì)胞遷移情況,隨機選取5個視野進行拍照,重復(fù)4次。侵襲實驗:前期準(zhǔn)備同遷移實驗,將“1.2”項下3組細(xì)胞移到24孔板中(提前加入4%多聚甲醛 600 μL),室溫下固定15 min,用結(jié)晶紫進行染色。將上室內(nèi)部細(xì)胞擦拭干凈,在PBS等滲液中浸泡上室數(shù)次,將上室內(nèi)液體吸干,顯微鏡放大200倍下觀察細(xì)胞穿過情況,并進行拍照,對不同小室不同視野至少拍照10個部位,每3個平行孔為1組,計錄每個視野的細(xì)胞數(shù),重復(fù)4次,求平均數(shù)。

1.3.3 劃痕愈合實驗 在96孔板內(nèi)接種經(jīng)胰酶消化過的MCF-7細(xì)胞進行培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞融合度大于80%后用移液器頭行縱向劃痕,用PBS等滲液漂洗2次,加入含2%胎牛血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),分別在0 h和24 h時進行拍照。

1.3.4 Western blot法檢測Ki-67、PD-L1的蛋白表達(dá)水平 取“1.2”項下3組細(xì)胞,將總蛋白提取、轉(zhuǎn)膜電泳內(nèi)參為GAPDH,采用免疫印跡法檢測3組細(xì)胞Ki-67、PD-L1蛋白的相對表達(dá)量。一級抗體包括Ki-67(ab92742,稀釋比1∶5 000),PD-L1(ab213524,稀釋比1∶1 000),GAPDH(ab8245,稀釋比1∶1 000)。蛋白質(zhì)條帶用Pierce ECL Western Blotting Substrate進行掃描。采用Image J軟件測定條帶灰度值,目的蛋白的相對表達(dá)水平以條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值進行反映。

1.3.5 PCR法測定PD-L1、Ki-67的RNA表達(dá)水平 取“1.2”項下3組細(xì)胞,采用Trizol法提取總RNA,采用分光光度計法檢測提取RNA的濃度及純度。按照Prime Script RTreagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,根據(jù)SYBR Premix Ex Tao TMⅡ熒光定量PCR試劑盒(日本Takara公司)說明書,制備反應(yīng)體系進行擴增,引物序列見表1。

表1 RT-qPCR法檢測引物序列

2 結(jié)果

2.1 不同濃度丙泊酚對人乳腺癌雌激素受體陽性MCF-7細(xì)胞增殖的影響不同濃度丙泊酚對人乳腺癌雌激素受體陽性MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)10 d后,與P0組比較,P25組和P50組細(xì)胞數(shù)量均增多,且P50組增加較明顯,見圖1、2 。

圖1 不同濃度丙泊酚中人乳腺癌雌激素受體陽性MCF-7細(xì)胞增殖圖

圖2 不同濃度丙泊酚對人乳腺癌雌激素受體陽

2.2 不同濃度丙泊酚對人乳腺癌雌激素受體陽性MCF-7細(xì)胞遷移能力的影響不同濃度丙泊酚對人乳腺癌雌激素受體陽性MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,與P0組比較,P25組細(xì)胞遷移數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),P50組細(xì)胞遷移數(shù)量增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3、4。

圖3 不同濃度丙泊酚中人乳腺癌雌激素受體陽性MCF-7細(xì)胞遷移培養(yǎng)圖

圖4 不同濃度丙泊酚對人乳腺癌雌激素受體陽性MCF-7細(xì)胞遷移能力的影響

2.3 不同濃度丙泊酚對人乳腺癌雌激素受體陽性MCF-7細(xì)胞侵襲能力的影響不同濃度丙泊酚對人乳腺癌雌激素受體陽性MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,與P0組比較,P25組細(xì)胞侵襲數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),P50組細(xì)胞侵襲數(shù)量增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖5、6 。

圖5 不同濃度丙泊酚中人乳腺癌雌激素受體陽性MCF-7細(xì)胞侵襲培養(yǎng)圖

圖6 不同濃度丙泊酚對人乳腺癌雌激素受體陽性

2.4 不同濃度丙泊酚對人乳腺癌雌激素受體陽性MCF-7細(xì)胞愈合的影響劃痕后即刻(0 h)3組細(xì)胞劃痕間距相等。24 h后,P50組細(xì)胞劃痕間距最小,P25組細(xì)胞劃痕間距最寬,見圖7。

圖7 不同濃度丙泊酚對人乳腺癌雌激素受體陽性MCF-7細(xì)胞愈合圖

2.5 不同濃度丙泊酚對人乳腺癌雌激素受體陽性MCF-7細(xì)胞PD-L1、Ki-67蛋白表達(dá)水平的影響加入不同濃度的丙泊酚干預(yù)24 h后,與P0組比較,P25、P50組Ki-67蛋白表達(dá)水平增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001);P25組與P50組間Ki-67蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。3組間PD-L1蛋白表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1),PD-L1表達(dá)水平隨著丙泊酚濃度的增加而增高,見圖8、9。

圖9 不同濃度丙泊酚對Ki-67、PD-L1蛋白表達(dá)水平的影響

2.6 PCR檢測不同濃度丙泊酚對人乳腺癌雌激素受體陽性MCF-7細(xì)胞PD-L1、Ki-67的RNA表達(dá)水平的影響3組間PD-L1、Ki-67的RNA表達(dá)水平比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001),PD-L1表達(dá)水平隨著丙泊酚濃度的增加而增高,見表2、圖10。

圖10 PCR 法檢測3組細(xì)胞中PD-L1和Ki-67的RNA表達(dá)水平

表2 3組細(xì)胞中PD-L1和Ki-67的RNA表達(dá)水平

3 討論

有動物實驗研究發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)劑量的丙泊酚可以通過GABAAR-TRIM21-Src機制來促進腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、粘附能力[14]。MENG等報道持續(xù)泵注2～10 ug/mL的丙泊酚1～12 h可增加人乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力[15]。本研究在人乳腺癌雌激素受體陽性MCF-7細(xì)胞中加入不同濃度丙泊酚,發(fā)現(xiàn)加入高濃度(50 μg/mL)丙泊酚后MCF-7細(xì)胞遷移能力增強,侵襲細(xì)胞和細(xì)胞克隆數(shù)量明顯上升,增殖能力增加,因此認(rèn)為高濃度丙泊酚能夠促進人源乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、遷移、侵襲。有研究表明,丙泊酚可減少全乳房切除術(shù)乳腺癌患者的局部復(fù)發(fā),抑制腫瘤細(xì)胞的活性,降低術(shù)后病死率[16-17]。

丙泊酚可通過乳腺癌細(xì)胞中不同的分子機制來發(fā)揮促腫瘤或抗腫瘤的活性,乳腺癌細(xì)胞的高異質(zhì)性和繁多的蛋白標(biāo)志物可能會掩蓋丙泊酚的作用機制[18]。Ki-67是反映乳腺腫瘤細(xì)胞生長情況的重要蛋白,與細(xì)胞增殖有關(guān),陽性率越高,腫瘤生長越快,通常被作為某些惡性腫瘤的預(yù)后生物標(biāo)志物[19]。腫瘤細(xì)胞通過刺激T細(xì)胞上的程序性死亡配體1(PD-L1)來耗盡活化的T細(xì)胞,從而答到逃避免疫監(jiān)測,對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)有著“保護”作用,能夠使腫瘤細(xì)胞存活率更高、體積更大、增殖能力更強[20-21]。本研究結(jié)果表明,經(jīng)高濃度丙泊酚處理后,人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的PD-L1、Ki-67蛋白表達(dá)增高,提示高濃度丙泊酚促進乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、遷移、侵襲,且這種生物行為學(xué)改變可能與Ki-67、PD-L1的表達(dá)增強有關(guān)。

綜上所述,高濃度的丙泊酚可以促進人乳腺癌雌激素受體陽性MCF-7細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力,這種細(xì)胞生物學(xué)行為的改變是通過增加PD-L1、Ki-67表達(dá)來實現(xiàn)的。