高細胞亞型甲狀腺乳頭狀癌臨床病理分析與蛋白質組學研究

王維娜, 陳海霞, 張 煥, 楊 波, 蒲紅偉

(新疆醫科大學1附屬腫瘤醫院病理科, 2第一附屬醫院學科建設科, 烏魯木齊 830011)

甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC)有14個組織學亞型,其中最常見的是經典型(Classical PTC,CPTC),PTC總體預后良好,但是臨床中存在一些PTC 亞型比經典型更具侵襲性,其中高細胞亞型(Tall cell subtype PTC,TC-PTC)是最常見的侵襲變異型,易侵犯甲狀腺被膜外結締組織及骨骼肌、易出現局部復發、淋巴結轉移甚至遠處轉移[1]。2022年甲狀腺癌診療指南中提出:高侵襲性PTC亞型(如高細胞、柱狀細胞、彌漫硬化型等)具有中度復發風險,術后考慮放射性碘治療。TC-PTC在HE形態上有時與CPTC難以鑒別,特別是形態不典型或者占比較少的時候,極易漏診,為了提高TC-PTC診斷率,讓患者獲得精準治療,降低復發和轉移風險,本研究利用非標記定量技術(label-free)聯合質譜分析,首次評估高細胞亞型PTC與經典型PTC及良性甲狀腺結節(Benign thyroid nodules,BTN)蛋白質組譜,初步篩選TC-PTC潛在生物標志物,為進一步開展蛋白功能驗證及完善侵襲性PTC亞型背后的分子機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本收集自2021年1月至2021年6月期間,因甲狀腺結節在新疆醫科大學附屬腫瘤醫院乳腺甲狀腺外科初次就診并手術,有術后常規病理資料的石蠟標本67例,TC-PTC17例,CPTC50例,其中17例TC-PTC、15例CPTC及另收集15例良性甲狀腺結節(Benign thyroid nodules,BTN)留取術中新鮮標本,-80℃凍存,進行質譜分析。

納入標準:(1)每例入組病例均由兩名高年資病理科醫師明確診斷。根據WHO(2022)甲狀腺腫瘤新分類作為診斷標準,CPTC定義為:具有纖維血管軸心的乳頭,襯覆PTC細胞學特征,即細胞核增大拉長擁擠、核膜不規則、核溝、核內包涵體及毛玻璃樣核。TC-PTC 定義為腫瘤細胞高度是寬度的3倍,且高細胞占比超過30%,胞漿豐富嗜酸且具有PTC典型的細胞核特征,拉長的濾泡或具有雙軌征的乳頭,見圖1;(2)入院前未行手術、碘治療的初治患者;(3)完整的臨床病理資料;(4)無其他臟器系統惡性腫瘤病史。排除標準:(1)除高細胞亞型及經典型之外的PTC其他組織學亞型;(2)高細胞占比小于30%的PTC;(3)兩名病理科醫師診斷意見不一致;(4)臨床或病理資料不完整,復發癌和遠處轉移至甲狀腺的惡性腫瘤。本研究經過新疆醫科大學附屬腫瘤醫院倫理委員會批準(倫理審批號:2021BC004),并取得患者知情同意。

注： 1A, 高細胞亞型甲狀腺乳頭狀癌(HE,×200); 1B, 經典型甲狀腺乳頭狀癌(HE,×200); 1C, 良性甲狀腺結節(HE,×100); 1D, 淋巴結轉移灶顯示腫瘤細胞的高細胞形態(HE,×200)。

1.2 實驗方法將47例-80℃凍存甲狀腺組織進行質譜分析,17例TC-PTC為A組,15例CPTC為B組,15例BTN為C組,每組3個重復。(1)提取蛋白質及肽段酶解:每組取0.1 g樣本,加液氮研磨成粉,加入適量蛋白裂解液,對樣品進行簡單的超聲波處理,于4℃,12 000 g,離心15 min。用Bradford法測定上清液中總蛋白含量。采用超濾輔助樣品制備(Filter aided sample preparation,FASP)酶解法制備蛋白質溶液樣品。(2)非標記定量質譜分析:通過液相色譜與串聯質譜法(LC-MS/MS)進行。(3)蛋白質鑒定及定量分析:利用Proteome Discoverer2.2軟件搜庫進行蛋白鑒定,根據 FDR<0.01的標準對數據進行篩選,以差異倍數(Foldchange)≥1.3倍,且P<0.05為標準進行顯著差異蛋白篩選。對篩選的差異表達蛋白應用火山圖展示結果。(4)差異表達蛋白功能分析:使用interproscan軟件進行GO功能注釋,KEGG數據庫對鑒定的蛋白質進行通路分析。利用String DB軟件預測蛋白質-蛋白質(PPI)相互作用。應用柱形圖和PPI互作圖展示結果。

1.3 統計學分析采用SPSS27.0軟件對數據進行統計學分析。組間差異性比較采用χ2檢驗和Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TC-PTC組與CPTC組臨床病理特征對比67例PTC患者年齡20～67歲(中位年齡44歲),男性19例,女性48例。TC-PTC組與CPTC組在患者年齡、性別及是否伴淋巴細胞性甲狀腺炎等方面差異無統計學意義(P>0.05)。TC-PTC組更易侵犯甲狀腺被膜及被膜外結締組織(其中2例伴被膜外帶狀肌群侵犯),1例TC-PTC伴脈管癌栓,更易出現多灶病變及淋巴結轉移,但差異無統計學意義(P>0.05)。TC-PTC組腫瘤最大徑大于CPTC組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 TC-PTC組與CPTC組患者臨床病理特征對比/例(%)

2.2 差異蛋白鑒定結果利用label-free結合質譜技術對TC-PTC(A組)、CPTC(B組)及BTN(C組)3組進行相對定量分析,共鑒定出4 739個蛋白質,肽段數量34 294個。TC-PTC組、CPTC組與BTN組相比,差異蛋白數量分別是1 054個和862個,而TC-PTC組與CPTC組間差異蛋白數量為69個,見圖2火山圖。

注: 黑色代表差異不顯著的蛋白, 紅色代表上調蛋白, 綠色代表下調蛋白。

2.3 差異蛋白GO富集分析88.3%的TC-PTC/BTN上調差異蛋白質具有結合特性,包括磷脂結合、核酸結合、有機環狀化合物結合等,主要參與翻譯、細胞氮化合物代謝、非同源末端連接(NHEJ)修復通路等,從細胞組分來看,主要構成核糖核蛋白復合體。見圖3。TC-PTC/CPTC組中16個上調差異蛋白參與肌動蛋白細胞骨架組成、銨離子轉運、核苷酸分解代謝等過程,涉及磷脂結合、核酸結合、磷脂化合物結合等結合功能。

圖3 A/C組上調差異蛋白GO功能富集

2.4 差異蛋白質KEGG富集分析通過KEGG注釋在TC-PTC組與BTN組中分析了310個差異蛋白,影響體內13條代謝通路(P<0.05),其中核糖體生物合成、蛋白酶復合體、剪接體組成、磷酸戊糖途徑、RNA轉運等通路影響位點較多,富集的顯著差異蛋白包括:核糖體蛋白、蛋白酶體亞基、剪接體復合物等(PHF5A、U2SURP、剪接因子3b蛋白復合物SNRPD1)、核孔復合體蛋白等,見圖4。基于KEGG注釋的TC-PTC組與CPTC組的9個上調差異蛋白在煙酸和煙酰胺代謝、剪接體組成、軸突導向等過程顯著富集。富集到胞外5′-核苷酸酶(CD73/NT5E),煙酰酸磷酸核糖基轉移酶(NAPRT)、剪接體復合物、神經纖毛蛋白(NRP1)等。

圖4 蛋白酶復合體

2.5 差異蛋白的互作調控網絡利用String在線軟件分析TC-PTC組、CPTC組及BTN組差異表達蛋白質相互作用的調控網絡(圖5)。TC-PTC/BTN組間互作蛋白質數量最多,其中上調蛋白以蛋白酶體各亞基和核糖體蛋白大小亞基互作關系為主。TC-PTC/CPTC的上調和下調差異蛋白中,與蛋白質B2RBH2(CD73)互作的蛋白質數量最多有7個,其中與Q6XQN6(NAPRT)互作關系最密切。

注: 桔色節點代表上調蛋白; 綠色節點代表下調蛋白。

2.6 組間篩選的差異蛋白交叉分析將TC-PTC/BTN、TC-PTC/CPTC、TC-PTC/BTN三組間上調差異蛋白合并保留,差異倍數均在1.3倍以上,P<0.05。通過韋恩圖觀察到每組特有或共同的差異表達蛋白數量(圖6)。TC-PTC組、CPTC組與BTN組間共同表達上調蛋白459個,TC-PTC組與CPTC組間上調差異蛋白數較少,共36個。與CPTC組及BTN組相比,TC-PTC組顯著高表達的蛋白14個,分別是:RARRES2、DPY19L1、CD73、SNRPA1、NUP62、PHF5A、U2SURP、NAPRT及TC-PTC組特有6個蛋白:NRP1、MTM1、COG1、SRP19、PRR15、CDC2L5。通過分析差異蛋白生物學功能、富集的生化代謝途徑及查閱文獻,我們挑選出CD73、SNRPA1、NRP1及NAPRT這4個感興趣的蛋白作為探索目標。

圖6 TC-PTC(A組)、CPTC(B組)及BTN(C組)

3 討論

本研究發現,與CPTC組患者相比,TC-PTC組患者的病變體積偏大(P<0.05),更易出現多灶病變、易侵犯甲狀腺被膜及發生淋巴結轉移,但差異無統計學意義(P>0.05),這一結論與Bongers等[2]的研究結果一致,提示TC-PTC臨床生物學行為更具有侵襲性,這一組織學類型的PTC需要引起關注。本研究利用Label-free與LC-MS/MS相結合,鑒定高細胞亞型PTC、經典型PTC和良性甲狀腺結節組織中變化的蛋白質。TC-PTC組與BTN對照組間差異蛋白最多,有1 054個,TC-PTC組與CPTC組間差異蛋白僅有69個,高細胞亞型和經典型PTC之間的差異蛋白數量少,可能歸結于兩類PTC亞型有相似的組織學特征,都屬于分化型甲狀腺癌,但TC-PTC惡性程度更高,精確的組織學分型有利于患者精準治療。本研究利用GO及KEGG通路分析發現,TC-PTC差異蛋白主要富集于核糖體生物合成、蛋白酶復合體組成、剪接體組成、磷酸戊糖途徑等代謝通路。泛素-蛋白酶體系統是細胞內調節蛋白降解的最主要方式,影響細胞內多級信號串聯,促進細胞增殖,目前已成為抗癌治療的重要靶點[3]。本研究也發現多種26S蛋白酶體調節亞基在TC-PTC組及CPTC組表達增高,提示蛋白酶體系統可能在甲狀腺濾泡上皮惡性轉化中起關鍵作用。磷酸戊糖途徑(PPP)提供了惡性腫瘤快速增殖所需要的大量核苷酸和脂質,關鍵酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)促進腫瘤細胞對葡萄糖的攝取,參與多種信號通路[4]。本研究也證實了G6PD和PPP非氧化階段的轉酮醇酶等在兩類PTC亞型中活性均增高,提示磷酸戊糖代謝參與了甲狀腺濾泡上皮惡性發展進程。

RNA剪接失調與癌癥發展與治療密切相關,已成為腫瘤生物學及遺傳學研究熱點[5]。本研究TC-PTC組富集到U2 snRNP剪接復合物的重要亞單位(SNRPA1、PHF5A)和剪接體相關蛋白(U2SURP)的高表達,說明RNA剪接事件可能影響TC-PTC的發生。本研究結合TC-PTC顯著上調差異蛋白的生物學功能及參與的代謝途徑和信號通路,進一步結合文獻復習,篩選出4個可能與TC-PTC發生進展相關的蛋白,分別是:CD73、SNRPA1、NRP1、NAPRT。

胞外核苷酸酶(NT5E/CD73)主要是將細胞外磷酸腺苷(AMP)去磷酸化成腺苷,它還是一種介導癌癥侵襲和轉移的黏附信號分子,腫瘤細胞和間質細胞過表達CD73促進腫瘤進展[6-8]。研究者發現甲狀腺乳頭狀癌細胞具有更高的AMP分解能力和CD73表達水平,利于細胞外腺苷在腫瘤微環境中的積聚,促進PTC細胞的增殖和遷移,CD73已成為甲狀腺乳頭狀癌(PTC)潛在預后和治療標志物[9-10]。本研究發現CD73在三組中均有表達,在TC-PTC組表達量最高,BTN組表達最低。我們在核苷酸代謝及煙酸和煙酰胺代謝中均捕獲到此蛋白,CD73在TC-PTC/CPTC組間差異蛋白中是核心分子,與之互作的蛋白數量最多,推測CD73可能是TC-PTC的潛在生物標志物。小核糖體核蛋白A1(SNRPA1)是主要剪接體成分U2 sn RNP的重要剪接因子,參與特異性剪接體的組裝、獲取、維持[11]。研究者構建了干擾SNRPA1的慢病毒載體,shSNRPA1組明顯抑制胃癌細胞的生長增殖[12]。本研究在TC-PTC組中發現三種重要剪接因子上調表達,其中SNRPA1在TC-PTC組表達量最高,推測SNRPA1可能參與TC-PTC RNA剪接事件發生。煙酸磷酸核糖基轉移酶(NAPRT)通過上調煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)水平促進結腸癌、胰腺癌及前列腺癌細胞糖酵解和增殖活性[13],本研究發現TC-PTC中NAPRT蛋白含量高于CPTC和BTN,推測NAPRT表達與PTC生物學行為相關,這一結論有待在基因和蛋白水平進一步驗證。神經纖毛蛋白-1(NRP1)為Ⅰ型跨膜糖蛋白,充當細胞表面受體中心,通過多個信號級聯反應促進腫瘤細胞生長、血管形成和轉移[14-15]。本研究中NRP1僅在TC-PTC中表達,其他兩組均未檢測到,推測NRP1可能成為TC-PTC潛在生物標志物。

綜上所述,本研究提供了高細胞亞型PTC、經典型PTC及良性甲狀腺結節蛋白質組學的初步信息,篩選出4個在TC-PTC中高表達且可能具有臨床意義的興趣蛋白,下一步尚需擴大樣本量開展蛋白功能驗證,探討這4個差異蛋白作為高細胞亞型甲狀腺乳頭狀癌特異性腫瘤標志物的可能性,為高侵襲性亞型甲狀腺乳頭狀癌發生進展機制的研究提供理論依據。