彌漫大B細胞淋巴瘤微環境中CD4、CD8表達及IL-6水平與TP53等位基因缺失的相關性研究

龐雪蓮, 馬佳佳, 駱婷婷, 李君娜, 張 巍,, 崔文麗,

(1新疆醫科大學第一附屬醫院病理科, 烏魯木齊 830054; 2新疆醫科大學, 烏魯木齊 830017)

彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)是最常見的淋巴造血系統惡性腫瘤[1]。30%～40%的DLBCL經R-CHOP方案治療后仍然復發[2],因此難治性耐藥性患者亟需尋求新的治療方案。由于DLBCL與人體免疫系統密切相關,已有部分DLBCL患者嘗試運用免疫治療,僅部分患者能從中獲益,這與患者的免疫微環境密切相關[3]。TP53野生型發揮著抑癌的作用,當其發生突變、缺失等變異后抑癌作用消失,并與多種腫瘤的發生、發展有關[4]。在慢性白血病中發現TP53常以等位基因缺失形式出現,其中80%可出現TP53突變[5]。雖然TP53突變及等位缺失頻率在DLBCL中比例不高,卻是患者預后差和發生耐藥的重要因子[6]。

白細胞介素-6(IL-6)在機體的多種炎癥活動中都起到重要作用,有研究表明,惡性淋巴瘤患者血清IL-6水平明顯升高[7]。CD4+、CD8+T 細胞是腫瘤浸潤淋巴細胞(Tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)中的一員,是DLBCL判斷預后、指導治療的重要因子[8]。免疫細胞可受到TP53的調節,它能通過促進B細胞、T細胞、樹突細胞和巨噬細胞表面的toll樣受體表達來增強細胞免疫介導的固有免疫反應[9]。目前關于DLBCL中TP53基因狀態與免疫微環境之間的作用機制報道較少,故本研究主要分析免疫微環境中的CD4+、CD8+T細胞及IL-6與TP53等位基因缺失之間的相關性,為DLBCL選擇免疫檢測點提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集新疆醫科大學第一附屬醫院2012-2017年間DLBCL標本,均經過新疆醫科大學第一附屬醫院醫學倫理委員會審批(倫理審批號:K202106-04),所有的病例均經兩名高年資病理醫生復診,按照2017年WHO淋巴造血系統腫瘤分類,經篩查174例樣本合格納入研究,并制作組織芯片。收集伴TP53等位基因缺失及未缺失DLBCL患者的血液標本各10例。收集患者的臨床病史及治療等信息,并通過查閱病例或電話隨訪。隨訪時間從確診到2022年8月1日。174例患者中男性97例,女性77例,男女比例1.3∶1;年齡5～87歲,中位年齡59歲;按照Ann Arbor分期:Ⅰ～Ⅱ期45例, Ⅲ～Ⅳ期129例;組織分型:非生發中心B細胞型(NGCB)116例,生發中心B細胞型(GCB)45例;國際預后指數(IPI)評分:≤1分63例,>1分111例;體力狀況(PS)評分:≤1分134例,>1分40例。

1.2 常規HE及免疫組化染色標本經3.7%的中性甲醛緩沖液固定、常規脫水、石蠟包埋、3～4 μm石蠟切片,行HE染色定位后制作組織芯片,組織芯片應用于全自動免疫組化染色。p53、CD4、CD8抗體購自羅氏生物科技有限公司。采用已知陽性片作為陽性對照。p53蛋白表達判讀:>80%腫瘤細胞核彌漫一致的陽性為強陽,30%～80%腫瘤細胞核著色為少-中陽,<30%的腫瘤細胞核著色或腫瘤細胞不著色定義為陰性[10-11]。CD4、CD8蛋白判讀:細胞膜/質著色為黃色/棕黃色/棕褐色,著色細胞百分比>5%,記為陽性;表現為細胞膜/質無著色,記為陰性。

1.3 熒光原位雜交上述組織芯片,60℃烤2 h,脫蠟水化后,進行預處理及酶消化后滴加探針,在Dako雜交儀上雜交16 h后,行2×SSC漂洗,再DAPI復染。探針為Vysis公司TP53(17p13.1)雙色熒光探針。熒光顯微鏡下計數100個有熒光信號的不重疊的腫瘤細胞,根據信號改變的細胞百分比來計算,判讀標準:正常細胞有2個紅色和2個綠色信號;細胞內有2個綠色信號,有1個或無紅色信號判讀為等位基因缺失,計數的100個細胞,缺失率達20%以上判為TP53等位基因缺失。

1.4 電化學發光免疫分析取初治前DLBCL患者外周血3 mL,置于無菌抗凝管內,3 000 r/min離心5 min,取上清,進行IL-6檢測。檢測儀器為羅氏公司的Cobas 6000全自動生化分析儀,試劑為羅氏公司的IL-6試劑盒。上機、選定檢測項目、運行儀器,質控合格后查看結果,以上嚴格按照儀器及試劑的說明書進行。

1.5 統計學處理采用SPSS 23.0軟件進行數據分析。計數資料以例(%)表示,組間比較采用χ2檢驗,生存分析采用Kaplan-Meier曲線法,多因素采用Cox比例風險回歸模型。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組織學特點多數DLBCL患者表現為全身淋巴結腫大,以淺表淋巴結為主。DLBCL患者淋巴結正常結構消失,瘤細胞彌漫生長,瘤細胞增大,GCB型DLBCL腫瘤細胞表現為細胞核圓形或卵圓形,染色質呈空泡狀,有2～4個靠近核膜的小核仁;NGCB型DLBCL則表現為細胞質較豐富,核圓形,明顯的中位核仁(圖1)。

注: A, p53蛋白強陽性表達; B, p53蛋白少-中陽性表達; C, DLBCL GCB型組織學形態; D, DLBCL NGCB型組織學形態。

2.2TP53等位基因狀態以及p53、CD4、CD8蛋白的表達情況174例DLBCL病理組織FISH檢測結果顯示,TP53等位基因缺失率為21.8%(38/174)(圖2);免疫組化結果顯示p53蛋白強陽性率為10.9%(19/174)、少-中陽性率為29.9%(52/174),總陽性率為40.8%(71/174)(圖1);CD4、CD8蛋白表達以腫瘤間質的反應T細胞為主, CD4蛋白陽性率為1.72%(3/174),CD8蛋白陽性率為81.03%(141/174),見表1、圖3。

表1 TP53基因狀態、p53蛋白、CD8蛋白表達與DLBCL臨床病理特征之間的相關性/例(%)

注： A, TP53等位基因缺失的DLBCL病例中, 單個腫瘤細胞中可見2個綠色信號、1個紅色信號; B, TP53等位基因未缺失的DLBCL病例中,大部分細胞核存在2個綠色信號、2個紅色信號。

注: A, CD4蛋白表達; B, CD4蛋白未表達; C, CD8蛋白表達; D, CD8蛋白未表達。

2.3 IL-6水平比較10例TP53等位基因缺失的病例與10例未缺失的病例進行比較,結果顯示,兩組IL-6水平差異有統計學意義(P<0.05),TP53等位基因缺失組IL-6水平(124.49±48.49)pg/mL明顯高于未缺失組(41.45±29.97)pg/mL。

2.4TP53等位基因缺失與CD4、CD8蛋白表達及IL-6水平的相關性分析TP53等位基因缺失與p53蛋白表達、CD8蛋白表達、IL-6水平均有相關性。TP53等位基因缺失的病例中p53、CD8蛋白表達的陽性率分別為65.8%(25/38)、92.1%(35/38),而未缺失的病例中二者的陽性率分別為11.8%(16/136)、77.9%(106/136),顯示TP53等位基因缺失的病例中p53、CD8蛋白的陽性率高于未缺失組(P<0.05)。CD4蛋白陽性表達為3例,其中1例伴TP53等位基因缺失,但無統計學意義(P>0.05)。在p53蛋白表達不同強度的病例中,IL-6水平均值比較,差異有統計學意義(P<0.05),在p53蛋白強陽性的病例中IL-6水平均值最高,為(136.69±53.21)pg/mL,陰性病例中次之,為(71.45±33.73)pg/mL,少-中陽的病例中IL-6均值水平最低,為(39.14±33.17)pg/mL。

2.5 DLBCL患者預后分析有84位患者獲得了隨訪,隨訪時間5～60個月,中位隨訪時間為30個月。TP53等位基因缺失的DLBCL病例中總生存率低于未發生缺失的病例,但是p53蛋白表達為陰性、少-中陽、強陽的三組病例之間總生存率差異無統計學意義(圖4)。DLBCL多因素Cox比例風險模型分析發現,有無結外侵犯、疾病是否復發、TP53等位基因是否缺失均為DLBCL總生存率的獨立預后因素(P<0.05),結外侵犯、疾病復發及TP53等位基因缺失均為DLBCL患者總生存率的不良預后因素,疾病復發為無病生存的獨立不良預后因素(P<0.05)(表2)。

表2 總生存和無病生存多因素預后分析

圖4 TP53等位基因缺失和p53蛋白表達與DLBCL總生存之間的相關性分析

3 討論

TP53基因與DLBCL有密切關系,柴成國等[12]學者FISH檢測DLBCL組織中TP53等位基因缺失率為33.75%。Zenz等[13]學者用測序法檢測侵襲性B細胞淋巴瘤(B-NHL)中TP53基因的突變率為23.8%,并且在p53蛋白高表達的病例中突變率更高,他們研究的病例中p53蛋白的陽性率為18.5%。本研究中TP53等位基因的缺失率為21.8%,略低于柴成國等學者的研究結果,可能來自于樣本之間的地域差異,尚需進一步對比研究。DLBCL也屬于侵襲性B細胞淋巴瘤,但是本研究中p53蛋白的表達情況與Zenz等的研究結果差異較大,本研究中p53蛋白的總陽性率高于Zenz等的研究結果,兩項研究的差異從以下方面進行分析:首先,兩者檢測平臺、試劑不一致,Zenz等用的為DAKO的檢測平臺及抗體,本實驗使用的為羅氏的檢測平臺及試劑;其次,蛋白表達判讀標準不一致,Zenz將p53表達分為陰性和陽性兩組,>10%的腫瘤細胞強陽性,判為陽性,而本實驗將p53蛋白表達分為陰性、少-中陽、強陽三組,尤其是少-中陽組納入了非強陽性表達病例,導致陽性比例升高。由于在很多腫瘤中可以根據p53蛋白的表達模式來推測TP53基因的突變狀態,比如在子宮漿液性癌中p53蛋白強陽性及陰性的病例中可能存在TP53基因突變,而在p53蛋白呈現少-中陽時則TP53基因則可能為野生型[13],本研究結果也證實了TP53在p53蛋白強陽性的病例中等位基因缺失率最高,在少-中陽性病例中發生最低,因此推測在DLBCL中p53蛋白強陽性表達時存在TP53等位基因缺失概率較高。

伴有TP53等位基因缺失是DLBCL預后差的影響因子[14]。本研究結果顯示:TP53等位基因缺失在DLBCL Ⅲ～Ⅳ期的發生率高于Ⅰ～Ⅱ期,是患者不良預后因子。有關TP53基因在DLBCL中是如何發揮作用的,考慮調節免疫微環境是一條重要途徑,野生型TP53基因可間接抑制免疫微環境中IL-6、COX2、iNOS等細胞因子的產生與釋放,進而抑制炎癥反應的產生,最終抑制腫瘤的進展[15]。但是在DLBCL中,TP53與IL-6的關系尚不明確,有研究證實,TP53等位基因缺失誘導IL-6/JAK/STAT3通路突變增加,是多發性骨髓瘤預后差的因子[16]。滑膜炎癥病變時,當TP53基因突變后喪失了對IL-6的抑制作用,促進其水平升高[17]。本研究結果顯示TP53等位基因缺失的DLBCL病例中IL-6均值水平明顯高于未缺失的病例,推測在DLBCL中也存在TP53等位基因缺失后促進IL-6水平升高。

p53蛋白表達與IL-6水平也存在相關性,有學者研究證實結直腸細胞系中,p53可以通過抑制IL-6R/STAT3/MIR-34a信號通路間接抑制IL-6水平升高[18],本研究中IL-6在p53蛋白強陽性的DLBCL病例中均值水平最高,陰性次之,而在少-中陽的病例中水平最低,進一步說明p53蛋白表達需要詳細分層,才能更準確的分析其與各項臨床參數的相關性。IL-6與細胞免疫也有相關性,IL-6能夠抑制CD4+、CD8+T 細胞發揮免疫抑制的作用,有研究報道,再生障礙性貧血的患者經治療下調IL-6后,患者血清CD4/CD8比值增高,免疫功能提高[19]。本研究中TP53等位基因缺失的病例中CD4陽性率低、CD8陽性率高,CD4/CD8比值相對減小,IL-6水平高。因此推測,TP53基因缺失后促進腫瘤微環境中IL-6水平增高,CD4/CD8比值減小,發生免疫抑制,最終促進腫瘤的進展。但是由于本研究中檢測的IL-6病例較少,尚需擴大樣本進一步證實。

本研究中Cox風險模型分析顯示,TP53等位基因缺失、結外侵犯、疾病復發是DLBCL不良預后的獨立影響因素。Zenz等學者也證實TP53等位基因缺失是DLBCL患者不良預后的影響因素,不同的是,Zenz等的研究結果顯示p53陽性與侵襲性B細胞淋巴瘤不良預后相關[13],而本研究卻顯示p53蛋白表達情況與患者的總生存無明顯相關性,我們分析這與p53蛋白判讀差異有關,使得預后情況發生了差異,本研究刪失了一部分病例,可能也影響了結果分析,待擴大樣本量、延長隨訪時間進一步明確。

本研究推測TP53等位基因缺失后通過刺激IL-6水平增高,抑制CD4+、CD8+T細胞發揮免疫作用,進而調節DLBCL免疫微環境。建議TP53可作為免疫檢測點,為難治性復發性DLBCL患者接受免疫治療提供理論證據,但是基因檢測費用昂貴、檢測難度高,而常規的免疫組化檢測周期短、價格便宜、易實現,因此建議用p53蛋白免疫組化檢測初步預測TP53基因狀態。