含jumonji結構域的蛋白2B和缺氧誘導因子1α在兒童非霍奇金淋巴瘤組織中的表達及意義

刁玉巧 王儉 朱秀麗 陳健 鄭鈺 江蓮 劉月平 戴若恒 閆祎煒

（1.河北醫科大學第四醫院兒科，河北石家莊 050000；2.河北醫科大學第四醫院病理科，河北石家莊 050000）

淋巴瘤是兒童第三大常見腫瘤［1］，根據病理形態可分為霍奇金淋巴瘤（Hodgkin's lymphoma,HL）及非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma,NHL），其中NHL 約占兒童淋巴瘤的80%［2］。NHL在兒童中發病大多數為彌漫性、高度惡性，進展快，確診時臨床分期多為晚期。越來越多證據表明，組蛋白去甲基化酶導致的組蛋白甲基化異常在多種生物過程中起著至關重要的作用，這些過程常與癌癥的發生有關［3-4］。含jumonji結構域的蛋白（jumonji domain-containing protein, JMJD）2B 是組蛋白去甲基化酶JMJD 家族成員之一，其過度表達與腫瘤惡性增殖相關。研究發現JMJD2B在乳腺癌、胃癌、結直腸癌和肝細胞癌等多種癌癥中存在過表達［5-8］。

缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-lα）是在低氧條件下穩定和改變腫瘤細胞代謝的重要成分之一。研究表明，HIF-1α 通過促進腫瘤遷移、侵襲和血管生成，調節pH 和葡萄糖代謝，從而在多種腫瘤中過表達［9］，HIF-lα可能參與淋巴瘤發生、發展過程的調控［10］。目前有關JMJD2B在兒童NHL的研究尚未見報道。本研究通過免疫組化檢測JMJD2B 和HIF-1α 在兒童NHL 組織中的表達，分析二者與NHL 患兒臨床病理特征和預后的關系以及在NHL 組織中二者表達的相關性，探討二者在兒童NHL 發生發展中的作用，為該病的診斷、預后判斷及靶向治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性選取河北醫科大學第四醫院兒科2013—2022 年經病理確診的46 例NHL 患兒作為觀察組，以24 例淋巴結反應性增生患兒作為對照組。觀察組和對照組患兒年齡均為0～18歲。

收集患兒性別、年齡、淋巴瘤St.Jude 分期及病理分型、有無B 癥狀、血清乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH） 水平、 國際預后指數（international prognostic index, IPI）評分等資料。淋巴瘤診斷、St.Jude 分期及分型參照2016 版世界衛生組織造血與淋巴組織腫瘤分類標準進行［11］。B 癥狀包括：（1）無其他原因6 個月內體重減少＞10%；（2）近30 d 內無原因反復發熱＞38.0℃；（3）夜間盜汗。根據患兒年齡、體力狀況、臨床分期、淋巴結外受侵的部位數目及LDH 水平，將IPI評分分為低度危險（0～2分）和高度危險（3～5分）［10］。本研究已通過河北醫科大學第四醫院倫理委員會審批（2020ky228）。

1.2 免疫組織化學染色方法檢測JMJD2B 和HIF-1α

取觀察組和對照組石蠟組織標本進行切片、脫蠟、水化，將切片放入3% 過氧化氫溶液中滅活，置于檸檬酸抗原修復液（10 mM，pH 6.0）中進行抗原修復，滴加封閉用正常山羊血清工作液，室溫孵育，滴加JMJD2B鼠單克隆抗體、HIF-1α兔多克隆抗體（濃度分別為1∶150、1∶200）一抗，濕盒內4℃孵育過夜，加入生物素標記山羊抗兔工作液（濃度1 mg/mL）二抗，37℃孵育1 h，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育1 h。DAB顯色，蘇木素復染細胞核，脫水、封片，光學顯微鏡鏡檢。用磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照。

結果判讀：所有病理切片由2位資深病理科專家分別判讀。隨機選擇5個（10×20）視野，每個視野計數100個細胞中陽性染色細胞。根據染色程度評價染色強度：0 分為染色陰性，1 分為輕度染色，2 分為中度染色，3 分為強染色；根據切片中陽性細胞百分比進行評分：無陽性細胞計0 分，≤25%計1 分，26%～50%計2 分，＞50%～100%計3分。最后總評分=陽性強度評分×陽性百分比評分。總評分為0分定為陰性，1～2分、3～4分、6～9分分別標為+、++、+++，并將+、++、+++定為陽性［6，8，10］。

1.3 統計學分析

應用SPSS 27.0 軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以均值±標準差（±s）表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗。計數資料用例數和百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。JMJD2B表達與HIF-1α表達的相關性分析采用Spearman 秩相關分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料

觀察組46例患兒中，男27例，女19例，平均年齡（8.9±3.6）歲。對照組24 例患兒中，男15例，女9 例，平均年齡（9.1±3.8）歲。兩組間性別和年齡的比較差異均無統計學意義（χ2=0.095，P=0.758；t=-0.276，P=0.783）。

2.2 JMJD2B和HIF-1α的表達情況

觀察組JMJD2B陽性表達率高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.001），見表1 和圖1。觀察組HIF-1α 陽性表達率亦高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.001），見表1和圖2。

圖1 對照組和觀察組的JMJD2B表達（×200） 對照組（A）及觀察組（B）淋巴結石蠟切片的細胞核內均可見JMJD2B 表達，觀察組JMJD2B 表達高于對照組。顆粒狀淺黃或棕黃色為JMJD2B 陽性表達（箭頭所示）。［JMJD2B］含jumonji 結構域的蛋白2B。

圖2 對照組和觀察組的HIF-1α 表達（×200） 對照組（A）及觀察組（B）淋巴結石蠟切片的細胞核內均可見HIF-1α表達，觀察組HIF-1α表達高于對照組。顆粒狀淺黃或棕黃色為陽性表達（箭頭所示）。［HIF-1α］缺氧誘導因子1α。

表1 觀察組及對照組JMJD2B和HIF-1α的陽性表達情況［例（%）］

2.3 JMJD2B和HIF-1α在NHL患兒組織中的表達與臨床特征的關系

JMJD2B 表達與NHL 患兒血清LDH 水平及IPI危險度相關（均P＜0.05），與患兒性別、年齡、病理分型、St.Jude 分期及有無B 癥狀無關（均P＞0.05），見表2。

表2 JMJD2B和HIF-1α表達與NHL患兒臨床特征的關系［例（%）］

HIF-1α表達同JMJD2B一樣，與NHL患兒血清LDH 水平及IPI 危險度相關（均P＜0.05），與患兒性別、年齡、病理分型、St.Jude分期、有無B癥狀無關（均P＞0.05），見表2。

2.4 JMJD2B與HIF-1α在NHL患兒組織中表達的相關性

Spearman 秩相關分析顯示，JMJD2B 與HIF-1α在NHL 患兒組織中的表達呈正相關（rs=0.333，P=0.024）。

3 討論

淋巴瘤是一組以淋巴結和/或淋巴結外受累為特征的淋巴造血系統惡性腫瘤，兒童NHL 多為高侵襲性、高度惡性腫瘤，往往起病突然，生長迅速，臨床進展快，病情重，部分患兒發病早期即可出現死亡［12］。因此，臨床需尋找新的生物標志物探討其發病機制、早期診斷、預后判斷及干預。

JMJD2 家族蛋白包含2A、2B、2C、2D 4 個成員，能夠識別二甲基化和三甲基化H3K9、H3K36和三甲基化H1.4K26作為底物，引起以上蛋白的去甲基化。大多數JMJD 家族成員已被證實是白血病和實體瘤的致癌基因，在多種腫瘤發生發展、侵襲及轉移中發揮重要作用［13］，可促進腫瘤生長、侵襲和轉移。Toyokawa 等［14］通過免疫組化方法檢測到JMJD2B在肺癌中過表達，且陽性表達主要為核染色。苗曉紅［15］研究表明，JMJD2B在宮頸癌組織中表達上調，且與腫瘤直徑、腫瘤分化程度、淋巴結轉移及浸潤程度有關，可作為宮頸癌預后的預測指標。本研究結果顯示：觀察組JMJD2B陽性表達主要為核染色，其陽性表達率顯著高于對照組，提示JMJD2B在兒童NHL發生發展過程中可能發揮重要作用，可作為兒童NHL輔助診斷指標。這與既往國內外研究［13-15］結果一致。

JMJD2B在腫瘤中發揮作用可能通過以下機制。（1） 參與腫瘤細胞凋亡：研究證實通過應用JMJD2B 抑制劑SD49-7，抑制H3K9 的甲基化水平可促進腫瘤細胞凋亡［5］。有研究發現在彌漫性大B細胞淋巴瘤組織中組蛋白H3K9 甲基化表達增高［16］。（2）可調節細胞周期：研究表明，在結直腸癌中，JMJD2B 表達能夠通過誘導細胞發生G2/M 或者G0/G1 期阻滯從而導致腫瘤細胞增殖，并促進線粒體膜的破壞，導致來自于線粒體和Caspase-9、Caspase-3 的細胞色素C 的分裂［17］。（3）參與多種信號通路促進腫瘤細胞生長：有研究證實JMJD2B 可通過調節Wnt/β 鏈、TGF-β、Notch和PI3K通路促進腫瘤細胞生長［7］。上述通路的異常激活在NHL發生發展中亦發揮重要作用［18］。（4）參與腫瘤血管生成：實驗表明JMJD2B可以上調HIF-1α 的表達；可以調節血管內皮生長因子A表達，且血管內皮生長因子A作為促進血管生成的特異調節因子，在NHL中呈高表達［19-20］。

LDH 是一種細胞內糖酵解酶，廣泛存在于人體組織中。當正常組織惡變后，由于腫瘤細胞損傷及能量代謝障礙機制，腫瘤細胞釋放LDH增多，導致血清LDH 增高。研究表明血清LDH 水平在NHL 患者中可明顯升高［21］；LDH 水平對NHL 患者生存時間有顯著影響，可作為評估NHL 分期及預后的可靠指標［22］。

IPI是由國際NHL預后因素協作組于1993年提出的一個淋巴瘤預后判斷模型，可用來指導選擇治療方案，也可用來判斷預后，危險度越高，代表預后越差［10］。

本研究結果顯示兒童NHL組織中JMJD2B表達與患兒血清LDH 水平及IPI 危險度相關，提示JMJD2B 可判斷兒童NHL 病情程度、評估預后。Bur等［23］在對經典HL患者的研究中發現，JMJD2B的表達可能與經典HL的侵襲性亞型有關，且預示較差的無事件生存率。

Lu等［6］在對肝癌患者的研究中發現，JMJD2B表達與性別和年齡無關，與組織學分級和轉移分期相關。本研究結果顯示：JMJD2B在兒童NHL中的表達與患兒性別、年齡、淋巴瘤病理分型及St. Jude 分期均無關；JMJD2B 表達在兒童NHLⅢ、Ⅳ期的陽性率均高于Ⅱ期，但差異無統計學意義，考慮可能與樣本量較少相關。

HIF-1α 已被證實在多種腫瘤中表達上調，如多形性膠質母細胞瘤、黑色素瘤、肝癌、非小細胞肺癌、前列腺癌及甲狀腺癌等［24-29］。本研究結果顯示，HIF-1α表達在觀察組陽性率高于對照組，提示HIF-1α 在兒童NHL 發生發展過程中可能發揮重要作用。蔣潔等［30］研究發現，HIF-1α在NHL中呈高表達。本研究與既往國內研究［24-30］結果一致。

HIF-1α在腫瘤中發揮作用可能通過以下機制。（1）參與多種信號通路；在彌漫性大B細胞淋巴瘤中，HIF-1α可通過所介導的PI3K/AKT等多種信號通路在腫瘤發生發展中發揮重要作用［31］。（2）參與多種靶基因及轉錄因子的調控；BACH2 是一種B細胞特異性轉錄因子，在套細胞淋巴瘤中，HIF-1α 通過促進BACH2 轉錄從而促進腫瘤細胞存活［32］。（3）參與腫瘤血管生成，調節糖酵解：研究發現HIF-1α-VEGF 模式在兒童NHL 病變中起重要作用［33］。（4） 參與腫瘤細胞侵襲、凋亡。（5）增加腫瘤細胞化療耐藥性：抗凋亡蛋白Bcl-xL已被證實與多種藥物耐藥有關，該蛋白受轉錄因子HIF-1α 調控。在NHL 細胞中，Bcl-xL 通過HIF-1α的表達可導致患者化療耐藥性的發生［34］。

蘇玉璇等［35］發現，在彌漫性大B 細胞淋巴瘤組織中，HIF-1α 表達與Ann Arbor 分期和IPI 相關；胡露露等［36］研究證實，在口腔頜面部淋巴瘤患者中，HIF-1α表達與血清LDH水平相關。蔣潔等［30］研究發現，在NHL中，HIF-1α表達在B細胞型與T細胞型之間無顯著性差異。本研究結果顯示HIF-1α 在兒童NHL 中的表達與患兒性別、年齡、淋巴瘤病理分型、淋巴瘤St. Jude 分期及有無B 癥狀均無關；其表達與NHL患兒血清LDH水平及IPI危險度相關，與國內外研究結果［30，35-36］一致。這提示HIF-1α可輔助判斷NHL患兒的病情程度和預后。

JMJD2B是HIF-1α下游靶點分子，HIF-1α誘導的JMJD2B表達有助于增強缺氧基因表達和腫瘤生長［37-38］。JMJD2B 可以通過催化啟動子H3K9 去甲基化，上調HIF-1α的表達［39］，影響腫瘤細胞增殖或凋亡，在癌癥血管生成和腫瘤分化中發揮重要作用。研究發現，在骨肉瘤及喉癌組織中JMJD2B和HIF-1α 表達呈正相關［40-41］；在結直腸癌中，JMJD2B 和HIF-1α 表達呈正相關，且HIF-1α 能通過增強JMJD2B的表達影響結直腸腫瘤細胞增殖活性［42］。本研究顯示，JMJD2B 與HIF-1α 在兒童NHL組織中的表達呈正相關，提示JMJD2B及HIF-1α可能在兒童NHL發生、發展中起協同作用。

綜上所述，JMJD2B和HIF-1α在兒童NHL組織中表達增高，二者在兒童NHL 發生發展過程中可能起協同作用；JMJD2B 可作為新的生物標志物輔助診斷兒童NHL、評估其病情程度、指導治療、預測預后，同時也為兒童NHL的治療提供新靶點。