毛發(fā)分析前沿——頭發(fā)微樣技術(shù)研究進(jìn)展

沈 敏，嚴(yán) 慧，徐多麒，紀(jì)佼佼

（司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專(zhuān)業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)司法部司法鑒定重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200063）

探尋具有科學(xué)屬性、豐富信息和高證據(jù)價(jià)值的生物基質(zhì)是法醫(yī)毒物學(xué)領(lǐng)域的重要研究方向之一。毒（藥）物在毛干中的保留屬性賦予毛發(fā)基質(zhì)具有目標(biāo)物穩(wěn)定、檢出時(shí)限長(zhǎng)、可反映長(zhǎng)程攝毒（藥）史的特征，奠定了毛發(fā)分析在法醫(yī)毒物學(xué)以及臨床毒物學(xué)、興奮劑檢測(cè)等領(lǐng)域的重要證據(jù)地位和應(yīng)用價(jià)值[1-3]。 2016 年，ARMITAGE 等[4]在《科學(xué)》（Science）期刊上充分肯定了頭發(fā)的證據(jù)價(jià)值和研究?jī)r(jià)值，認(rèn)為“盡管頭發(fā)的應(yīng)用曾經(jīng)存在爭(zhēng)議，但現(xiàn)代精細(xì)分析技術(shù)將賦予頭發(fā)在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的新作用，通過(guò)頭發(fā)可以推斷犯罪嫌疑人或受害者的個(gè)體特征甚至行為信息”。 同期，基于單根頭發(fā)微樣技術(shù)的研究逐漸呈現(xiàn)[5-10]，其對(duì)于精準(zhǔn)表征毒（藥）物在毛干中的空間分布特征，精準(zhǔn)定位毛干中毒（藥）物的濃度高峰位置，提升頭發(fā)分析對(duì)于攝毒時(shí)間和攝毒模式判斷的準(zhǔn)確性，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

1 頭發(fā)微樣技術(shù)及其證據(jù)意義

1.1 頭發(fā)分析及其影響因素

頭發(fā)分析的應(yīng)用領(lǐng)域及證據(jù)價(jià)值隨著學(xué)界研究的深入而不斷得到拓展和提升。 在司法實(shí)踐中，頭發(fā)分析除主要應(yīng)用于攝毒鑒定、攝毒（藥）史判斷等案（事）件的處置外，也為藥物輔助犯罪（drug-facilitated crime，DFC）如性侵犯、麻醉?yè)尳俸驮p騙等案件的偵破提供案發(fā)時(shí)段是否攝毒（藥）的證據(jù)。 顯然，上述頭發(fā)分析證據(jù)對(duì)于攝毒模式（長(zhǎng)期攝毒、單次攝毒）的判斷基于時(shí)間要素，即是否在某特定時(shí)段攝入過(guò)毒（藥）物，或是否在某一時(shí)間周期內(nèi)多次濫用毒品？ 然而，目前傳統(tǒng)的頭發(fā)束發(fā)分段分析對(duì)于攝毒時(shí)間和攝毒模式的估計(jì)仍處于較大的誤差水平[7-9]。 如公安部制定的《涉毒人員毛發(fā)樣本檢驗(yàn)規(guī)范》（公禁毒〔2018〕938 號(hào)，以下簡(jiǎn)稱(chēng)《規(guī)范》）所述，“發(fā)根端3 厘米以?xún)?nèi)的頭發(fā)樣本檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的，表明被檢測(cè)人員在頭發(fā)樣本提取之日前6 個(gè)月以?xún)?nèi)攝入過(guò)毒品”。 可見(jiàn)，《規(guī)范》為確保現(xiàn)行頭發(fā)分析結(jié)果證據(jù)的可應(yīng)用性且不至于形成誤判，將近3 個(gè)月生長(zhǎng)的頭發(fā)（頭發(fā)生長(zhǎng)速度理論值約為1cm/月）所提供的時(shí)間信息擴(kuò)展了近1 倍，或者說(shuō)攝毒時(shí)間的分辨率達(dá)數(shù)月的誤差水平。 顯而易見(jiàn)，頭發(fā)束發(fā)分析對(duì)于攝毒模式和攝毒時(shí)間的估計(jì)尚存在精細(xì)度不夠、準(zhǔn)確性不足的缺陷，其應(yīng)用范圍和證明能力因而受到制約。

毒（藥）物在毛干中的保留位置是其攝入時(shí)間推斷的基礎(chǔ)。通常認(rèn)為毒（藥）物經(jīng)血液循環(huán)主動(dòng)或被動(dòng)地?cái)U(kuò)散至毛乳頭細(xì)胞，在形成毛髓質(zhì)、毛皮質(zhì)的過(guò)程中與其結(jié)合并保留于毛干中，隨著頭發(fā)的生長(zhǎng)由發(fā)根向發(fā)梢有規(guī)律的位移。縱觀頭發(fā)束發(fā)分析的原理和實(shí)踐，可以認(rèn)為導(dǎo)致時(shí)間分辨誤差問(wèn)題的關(guān)鍵是：頭發(fā)束發(fā)分析方法的原理、技術(shù)以及所提供的結(jié)果信息均是相對(duì)間接、綜合和粗略的。 即對(duì)由多根頭發(fā)組成的束發(fā)片段進(jìn)行分析，根據(jù)毒物在一束毛干上的疊加濃度高峰位置來(lái)提供時(shí)間信息的方法，不能準(zhǔn)確、精細(xì)和真實(shí)地顯示毒物在單根毛干上的分布情況。

頭發(fā)束發(fā)分段分析會(huì)受到以下因素的影響（圖1）：（1）生長(zhǎng)周期。 頭發(fā)的生長(zhǎng)呈現(xiàn)出周期性，分為生長(zhǎng)期、退行期和休止期。 通常頭部毛發(fā)大約有80%處于生長(zhǎng)期，20%處于退行期或休止期。 由于所采的束發(fā)中頭發(fā)處于不同的生長(zhǎng)周期，處于生長(zhǎng)期的頭發(fā)中毒（藥）物隨毛干生長(zhǎng)由發(fā)根向發(fā)梢位移，而處于休止期的頭發(fā)中毒（藥）物仍停留于毛干的原位或滯后位移， 故束發(fā)的片段分析所提供的是非一致的疊加信息。 （2）結(jié)合機(jī)制。 理論上認(rèn)為毒（藥）物進(jìn)入毛干存在多種渠道，既有通過(guò)血液循環(huán)進(jìn)入毛乳頭細(xì)胞，在毛干形成過(guò)程中與其結(jié)合的主渠道，也存在從汗液、皮脂腺等分泌進(jìn)入毛干或外部污染附著于毛干的次渠道。 而束發(fā)所導(dǎo)致的非一致疊加同樣不能有效識(shí)別、排除次渠道的干擾信息。（3）采樣誤差。頭部表面有一定的弧度，貼頭皮剪取一束頭發(fā)的采樣方式可能存在所采發(fā)束中各毛干根部與頭皮間距離不一致的誤差。 （4）分段長(zhǎng)度。 以厘米為單位的毛發(fā)片段分析不能有效捕捉和分辨毛干中毒（藥）物的濃度高峰位置。 上述因素均可能導(dǎo)致頭發(fā)中毒（藥）物濃度高峰分布存在一定的擴(kuò)散，由此與攝毒時(shí)間的對(duì)應(yīng)上存在較大偏差或較為模糊。 由此可見(jiàn)，現(xiàn)行頭發(fā)束發(fā)分段分析僅能提供藥物的暴露信息，而在攝毒模式以及攝毒時(shí)間的評(píng)估方面證明能力有限。

圖1 頭發(fā)束發(fā)分段分析干擾因素示意圖

1.2 頭發(fā)微樣技術(shù)及其信息特點(diǎn)

基于司法鑒定實(shí)踐中的科學(xué)證據(jù)需求以及傳統(tǒng)頭發(fā)束發(fā)分析中存在的缺陷，早在2011年學(xué)者們[5，11-12]就開(kāi)始探索使用基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption ionization-mass spectrometry，MALDI-MS）研究單根頭發(fā)中甲基苯丙胺、可卡因、氯胺酮等在頭發(fā)中的分布情況。 然而由于該技術(shù)平臺(tái)的靈敏度、分辨率尚不能完全滿(mǎn)足單根頭發(fā)中痕量外源性物質(zhì)的檢測(cè)要求，故突破性進(jìn)展緩慢。2016 年，KUWAYAMA 等[6]提出采用單根頭發(fā)的微樣技術(shù)，即建立以0.4 mm（約等于頭發(fā)日生長(zhǎng)長(zhǎng)度）為單位的單根頭發(fā)微分段分析技術(shù)，從相對(duì)微觀角度精準(zhǔn)考察單根毛干中外源性毒（藥）物的濃度高峰位置，以期獲得更高的時(shí)間分辨率。 此后，以單根頭發(fā)毫米或亞毫米分段（頭發(fā)段重量為微克級(jí)）的微樣技術(shù)又被稱(chēng)為頭發(fā)微分段分析（micro-segmantal analysis，MSA），其研究團(tuán)隊(duì)和研究報(bào)道也逐漸增多[13-21]。頭發(fā)微分段分析可以較為精準(zhǔn)地反映單根頭發(fā)中外源性物質(zhì)的分布情況，并為研究毒（藥）物進(jìn)入頭發(fā)的機(jī)制提供特有的信息。但由于所采集的研究對(duì)象（單根頭發(fā)）可能涉及某些不確定因素的影響（如頭發(fā)處于非正常生長(zhǎng)期等），故大部分學(xué)者認(rèn)為，MSA 分析至少應(yīng)同步采集、分析5~10 根頭發(fā)。

MSA 通常采用頭發(fā)全發(fā)（帶毛囊）樣品。單根頭發(fā)以毫米或亞毫米的間隔分段，然后對(duì)每段頭發(fā)微樣分別進(jìn)行處理、分析，以此獲得毒（藥）物在單根頭發(fā)中的濃度分布信息。 其中，對(duì)單根頭發(fā)進(jìn)行精準(zhǔn)微分段是實(shí)現(xiàn)對(duì)亞毫米長(zhǎng)度頭發(fā)中痕量毒（藥）物定量分析的前提。 頭發(fā)微分段過(guò)程包括頭發(fā)樣本固定、長(zhǎng)度測(cè)定、頭發(fā)切割等環(huán)節(jié)，主要有手動(dòng)切割法[18-19]以及改良的組織切片機(jī)切割法[5，6，13]。 手動(dòng)切割法通常采用精度為0.4 mm 的定制膠帶對(duì)單根頭發(fā)進(jìn)行測(cè)量與固定，并在臺(tái)式放大鏡下用手術(shù)刀片完成對(duì)單根頭發(fā)的切割（圖2）。 用精度為0.01 mm 的電子微分尺對(duì)所切割頭發(fā)段進(jìn)行測(cè)量驗(yàn)證，結(jié)果表明，頭發(fā)段長(zhǎng)度為（0.4±0.02）mm（n=50）時(shí)，誤差在可接受的范圍內(nèi)[18]。 設(shè)備切割法則多采用經(jīng)改良的組織切片機(jī)以0.4mm 間隔切割頭發(fā)，其長(zhǎng)度為（0.403±0.00419）mm（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n=15）[9]。 盡管兩者的操作方法不同，但均取得了較為理想的精度。

圖2 單根頭發(fā)0.4 mm 分段切割法

2 頭發(fā)微樣技術(shù)的應(yīng)用研究

用涉及法醫(yī)毒物學(xué)的多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行“microsegmantal analysisi，MSA”相關(guān)研究的搜索，目前研究報(bào)道主要集中于日本警察科學(xué)研究所團(tuán)隊(duì)、中國(guó)司法鑒定科學(xué)研究院團(tuán)隊(duì)、日本大阪市警察總部法科學(xué)實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊(duì)，以及德國(guó)慕尼黑法醫(yī)毒理學(xué)中心團(tuán)隊(duì)。 研究?jī)?nèi)容涉及頭發(fā)MSA 方法學(xué)研究、 攝毒攝藥時(shí)間評(píng)估研究、毒（藥）物在單根頭發(fā)中的分布研究、毒（藥）物進(jìn)入頭發(fā)機(jī)制研究、毛根中毒（藥）物動(dòng)力學(xué)研究等。

2.1 頭發(fā)MSA 方法學(xué)研究

檢測(cè)方法的高靈敏度是實(shí)現(xiàn)毛發(fā)微樣技術(shù)研究的必要條件。 隨著液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術(shù)的發(fā)展，為基于頭發(fā)MSA 的應(yīng)用研究提供了可能。 目前，文獻(xiàn)報(bào)道的頭發(fā)MSA 方法包括建立基于LC-MS/MS 技術(shù)平臺(tái)單一或多種目標(biāo)物的分析方法，涉及的目標(biāo)物有苯海拉明、氯苯那敏、去甲基氯苯那敏、非索非那定、雙氫可待因、麻黃堿、甲基麻黃堿、依匹斯汀、利多卡因、唑吡坦、甲氧基苯胺、艾司唑侖、西替利嗪、氯雷他定、咪達(dá)唑侖等[6-7，9，13，18，20-21]，所建方法主要用于所涉目標(biāo)物的攝毒時(shí)間、毛發(fā)結(jié)合機(jī)制等應(yīng)用研究，故通常以靈敏度為優(yōu)先考慮因素，檢出限為pg/mg 或fg/mm 水平。 由于MSA 方法中單根頭發(fā)片段質(zhì)量較小，因此研究者大多選擇以“濃度/長(zhǎng)度”或“濃度/段”作為量值單位。

頭發(fā)MSA 方法學(xué)研究還涉及一定目標(biāo)物范圍的篩選分析。 德國(guó)WIEDFELD 團(tuán)隊(duì)[19]建立了基于LC-MS/MS 技術(shù)分析單根頭發(fā)2 mm 片段中156 種毒（藥）物的方法，該方法檢測(cè)的156 種目標(biāo)物中，有140 種（約90%）目標(biāo)物的定量下限（lower limit of quantitation，LLOQ）≤1.25 pg/段，40 種（約26%）目標(biāo)物的LLOQ≤0.125 pg/段。 并且，除氯甲噻唑在低質(zhì)量控制水平下精密度較差（24.7%）外，其他所有目標(biāo)物測(cè)定的精密度均滿(mǎn)足要求。 將該方法應(yīng)用于15 例單次給藥案例，對(duì)藥后1 個(gè)月至2 個(gè)月采集的毛發(fā)（每例采集10 根頭發(fā)）進(jìn)行分析，結(jié)果表明，90%的目標(biāo)物的LLOQ≤1.25 pg/段，準(zhǔn)確度較好。 在上述案例中可以檢測(cè)到多種物質(zhì)，然而苯二氮類(lèi)藥物的檢測(cè)仍然具有挑戰(zhàn)性。 筆者所在研究團(tuán)隊(duì)[22]建立了基于單根頭發(fā)0.4 mm 片段中42 種精神活性物質(zhì)的LC-MS/MS 分析方法。 單根頭發(fā)微分段中42 種精神活性物質(zhì)在各自線(xiàn)性范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好（相關(guān)系數(shù)r>0.99），檢出限為0.2~10 pg/mg，定量限為0.5~20 pg/mg，日內(nèi)、日間精密度為1.5%~12.7%，日內(nèi)、日間準(zhǔn)確度為86.5%~109.2%，提取回收率為68.1%~98.2%，基質(zhì)效應(yīng)為71.3%~111.7%。將該方法應(yīng)用于志愿者單次服用唑吡坦28 d 后采集的頭發(fā)樣本的0.4 mm 分段分析，5 根頭發(fā)中唑吡坦的陽(yáng)性區(qū)域位于S28~S40（近根端1.08~1.60 cm），濃度范圍為0.62~20.5 pg/mm，結(jié)果顯示，頭發(fā)MSA技術(shù)可應(yīng)用于藥物輔助犯罪案件的調(diào)查。

對(duì)于頭發(fā)MSA 技術(shù)，人們關(guān)注的焦點(diǎn)是方法的靈敏度和檢出能力。 筆者認(rèn)為，基于MSA 技術(shù)的單一或多目標(biāo)物的頭發(fā)分析在檢出能力方面具有雙重性，一方面由于頭發(fā)樣品的微量導(dǎo)致檢出限值升高，檢出能力下降；另一方面由于更為精細(xì)的微分段可以減少陽(yáng)性頭發(fā)片段中空白頭發(fā)基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的稀釋作用，并降低頭發(fā)引起的基質(zhì)效應(yīng)，從而提高檢出能力。 隨著色譜-質(zhì)譜分析技術(shù)的發(fā)展，頭發(fā)MSA 的優(yōu)勢(shì)將更為突顯。 對(duì)于頭發(fā)MSA 的篩選分析，方法優(yōu)化總是基于分析靈敏度、目標(biāo)物數(shù)量、時(shí)間分辨率（片段長(zhǎng)度）三個(gè)因素間的平衡，而方法應(yīng)用則要關(guān)注檢出限值較高、頭發(fā)中含量較低的目標(biāo)物的可檢出性。

2.2 攝毒攝藥時(shí)間評(píng)估研究

頭發(fā)MSA 的最大優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)是通過(guò)精細(xì)的微分段精準(zhǔn)識(shí)別外源性物質(zhì)在單根毛干中的峰值位置，從而有可能在日水平上評(píng)估攝毒攝藥時(shí)間及模式，為各類(lèi)案（事）件的偵破、處置提供重要線(xiàn)索和依據(jù)。 如涉藥相關(guān)的非正常死亡案件中估計(jì)死者的死亡時(shí)間，藥物濫用相關(guān)案件中明確濫用者的濫用方式，藥物輔助犯罪案件中提供受害人的攝藥時(shí)間信息，以及通過(guò)毛干中毒（藥）物的分布特征區(qū)分單次攝藥的受害者和多次反復(fù)攝毒的濫用者等，進(jìn)而為案件提供支持證據(jù)。

KUWAYAMA 等[9]設(shè)計(jì)了一種可測(cè)量被分析頭發(fā)實(shí)際生長(zhǎng)速度的攝藥模型。 為準(zhǔn)確估計(jì)目標(biāo)藥物的攝入天數(shù)，受試者先服用苯海拉明（目標(biāo)藥物），然后以一定的時(shí)間間隔服用兩次氯苯那敏（時(shí)間標(biāo)記物）。 根據(jù)頭發(fā)中兩次時(shí)間標(biāo)記物的濃度高峰所在位置及相應(yīng)的攝藥時(shí)間來(lái)計(jì)算頭發(fā)的生長(zhǎng)速度， 再根據(jù)目標(biāo)藥物與時(shí)間標(biāo)記物峰值之間的距離和頭發(fā)的生長(zhǎng)速度來(lái)計(jì)算目標(biāo)藥物的攝入時(shí)間。 通過(guò)對(duì)甲基麻黃堿、撲爾敏、依匹斯汀、雙氫可待因和非索非那丁5 種時(shí)間標(biāo)志物進(jìn)行比較研究并評(píng)估該模型的準(zhǔn)確性[8]，認(rèn)為合適的時(shí)間標(biāo)記物可使攝藥時(shí)間估計(jì)誤差減小至2 d 以?xún)?nèi)，但當(dāng)時(shí)間標(biāo)記物與目標(biāo)藥物分布類(lèi)型不同時(shí)，攝藥時(shí)間推斷可產(chǎn)生約為10 d 的誤差。

本研究團(tuán)隊(duì)以藥物輔助犯罪案件中經(jīng)常涉及的艾司唑侖為目標(biāo)物，構(gòu)建了兩種基于頭發(fā)MSA技術(shù)的攝藥時(shí)間推斷模型[20]。其中：時(shí)間標(biāo)志物推斷模型采用志愿者以一定的時(shí)間間隔兩次攝藥后采集頭發(fā)，按照頭發(fā)生長(zhǎng)速度和毛干目標(biāo)藥物峰值間距離計(jì)算攝藥時(shí)間（圖3）；時(shí)間間隔推斷模型采用志愿者攝藥后以一定的時(shí)間間隔兩次采集頭發(fā)，根據(jù)兩次取樣時(shí)間間隔（ΔT）與兩次采集頭發(fā)樣品中形成的目標(biāo)藥物高峰位置移動(dòng)距離（ΔS）計(jì)算個(gè)體頭發(fā)生長(zhǎng)速度，然后按照?qǐng)D4 中所示公式計(jì)算攝藥時(shí)間。 本研究團(tuán)隊(duì)對(duì)所建立的兩種推斷模型從方法準(zhǔn)確度及適用性方面進(jìn)行比較分析，采用時(shí)間標(biāo)志物推斷模型進(jìn)行時(shí)間推斷的誤差平均為4.3 d，采用時(shí)間間隔推斷模型進(jìn)行時(shí)間推斷的誤差平均為7.4 d。筆者認(rèn)為，該兩種攝藥時(shí)間推斷模型的差異在于時(shí)間標(biāo)志物模型所用的是所測(cè)頭發(fā)的實(shí)際生長(zhǎng)速度，而時(shí)間間隔模型估計(jì)的頭發(fā)生長(zhǎng)速度并非所測(cè)頭發(fā)的實(shí)際生長(zhǎng)速度，這可能是該兩種時(shí)間推斷模型誤差存在差異的主要原因。

圖3 時(shí)間標(biāo)志物推斷模型

圖4 時(shí)間間隔推斷模型

頭發(fā)MSA 也用于估計(jì)死亡日期。 某非正常死亡尸體經(jīng)背景調(diào)查死者生前曾有使用利多卡因的醫(yī)療記錄，使用時(shí)間為發(fā)現(xiàn)尸體前57 d。 KUWAYAMA等[13]以利多卡因作為自然的內(nèi)部時(shí)間標(biāo)志物，根據(jù)利多卡因的使用時(shí)間以及單根毛干中利多卡因的濃度峰值位置估計(jì)死亡日期。 研究者認(rèn)為，與傳統(tǒng)的法醫(yī)病理學(xué)尸體檢查不同，頭發(fā)MSA 有可能將死亡時(shí)間范圍縮小至死亡日期。 本研究團(tuán)隊(duì)探索聯(lián)合使用基于LC-MS/MS 的MSA 技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜成像（matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry imaging， MALDI-MSI）技術(shù)，以提高攝藥時(shí)間估計(jì)的分辨率。 然而，受MALDI-MSI 分辨率的限制，想要獲得更高、更精確的時(shí)間分辨率仍較為困難。 此外，頭發(fā)中毒（藥）物可隨著頭發(fā)的生長(zhǎng)而擴(kuò)散和重新分布[23]，由此也影響了攝入時(shí)間估計(jì)的時(shí)間分辨率。 正如POETZSCH等[24]的研究也表明，無(wú)論采用何種方法，頭發(fā)分析的時(shí)間分辨率都是數(shù)天的范圍，而不能精確到確定的某一天。

筆者認(rèn)為，基于頭發(fā)MSA 估計(jì)攝毒攝藥時(shí)間仍處于研究階段，實(shí)踐中往往會(huì)存在一定的誤差，尤其應(yīng)關(guān)注以下因素的影響：（1）頭發(fā)采集應(yīng)采用拔取方式，全發(fā)（毛根和毛干）的長(zhǎng)度測(cè)量和MSA有利于精準(zhǔn)估計(jì)攝藥時(shí)間。 （2）根據(jù)頭發(fā)的生長(zhǎng)周期，采集選中靜止期和休止期的頭發(fā)將存在一定的概率，故MSA 必須獨(dú)立分析至少5 根或更多根頭發(fā)來(lái)保證結(jié)果的可重復(fù)性。 （3）即使在相同的頭部區(qū)域收集的頭發(fā)其生長(zhǎng)速度可能也存在差異，對(duì)此時(shí)間估計(jì)模型應(yīng)盡可能獲取所測(cè)單根頭發(fā)的實(shí)際生長(zhǎng)速度。 此外，用內(nèi)部時(shí)間標(biāo)記測(cè)算，研究團(tuán)隊(duì)所得志愿者的頭發(fā)生長(zhǎng)速度約為0.49~0.51 mm/d，KUWAYAMA 等[9]報(bào)道研究對(duì)象的頭發(fā)生長(zhǎng)速度平均值為（0.45±0.05）mm/d，即約1.4 cm/月。 隨著頭發(fā)分析研究的深化，有必要對(duì)頭發(fā)分析的基本理論假設(shè)（1 cm/月）或相關(guān)規(guī)定作出修正。

2.3 毒（藥）物在單根毛發(fā)中的分布研究

單根頭發(fā)MSA 可以較高分辨率描述毒（藥）物在單根頭發(fā)中的分布特征，包括從發(fā)根至毒（藥）物濃度峰值的距離和毒（藥）物陽(yáng)性區(qū)域的峰形，以及在頭部不同區(qū)域、不同頭發(fā)間分布的一致性，提供常規(guī)束發(fā)分段分析不能提供的精細(xì)信息。

2.3.1 不同區(qū)域頭發(fā)中毒（藥）物的分布研究

外源性毒（藥）物在頭部不同區(qū)域頭發(fā)中的分布是否存在差異，是否對(duì)攝藥模式和攝藥時(shí)間估計(jì)的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，是毛發(fā)分析領(lǐng)域需要關(guān)注的問(wèn)題。 本研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)人體頭部不同區(qū)域（枕部、左顳部、右顳部和頂部）的單根頭發(fā)進(jìn)行分析，以考察外源性毒（藥）物在不同區(qū)域內(nèi)頭發(fā)的分布情況以及同一區(qū)域內(nèi)不同單根頭發(fā)間分布的一致性。 三名志愿者單次攝取唑吡坦28 d 后分別在每一個(gè)體頭部的四個(gè)部位采集5 根頭發(fā)，結(jié)果顯示，在枕部和右顳部采集的15 根頭發(fā)均檢出唑吡坦，而左顳部和頂部分別有兩根和一根頭發(fā)呈陰性結(jié)果。 對(duì)同一部位采集的頭發(fā)濃度及峰濃度位置的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算結(jié)果顯示，枕部采集的頭發(fā)偏差值較小，其濃度峰值位置以及峰形分布一致性較好。圖5 顯示某志愿者攝藥后唑吡坦在頭部四個(gè)區(qū)域頭發(fā)中的分布情況。 研究結(jié)果表明，枕部頭發(fā)生長(zhǎng)速度變異性較小且處于生長(zhǎng)期的頭發(fā)數(shù)量較多，更適合作為頭發(fā)的采樣部位。 盡管?chē)?guó)際毛發(fā)分析協(xié)會(huì)已將枕部作為頭發(fā)分析推薦的采樣部位[25]，然而基于束發(fā)分析的數(shù)據(jù)其支撐能力尚有不足，而通過(guò)單根頭發(fā)的微分段分析可以更好地反映外源性毒（藥）物在不同部位頭發(fā)間分布的一致性。

圖5 唑吡坦在頭部不同區(qū)域頭發(fā)中的分布情況

2.3.2 頭發(fā)中毒（藥）物的進(jìn)入和保留機(jī)制研究

人體攝入毒（藥）物后短時(shí)間內(nèi)在單根頭發(fā)中的濃度-時(shí)間分布是揭示毒（藥）物進(jìn)入頭發(fā)機(jī)制的關(guān)鍵[21]。 幾乎所有的MSA 研究團(tuán)隊(duì)[6，9，20-21，25]在考察單次攝藥后目標(biāo)物在毛干中的分布時(shí)都觀察到了目標(biāo)物濃度的雙峰現(xiàn)象（圖6，S1、S2分別表示濃度高峰和濃度次高峰）。筆者研究團(tuán)隊(duì)的XU 等[20]考察了4 名志愿者單劑量攝入艾司唑侖12h、36 h、60 h、13 d、28 d 后目標(biāo)物在單根毛干上的分布情況。研究發(fā)現(xiàn)，攝藥后12~60 h 內(nèi)，在單根頭發(fā)上呈現(xiàn)兩個(gè)艾司唑侖濃度峰。其中，高峰位于毛根部的0~0.8 mm，次高峰位于毛根和毛干的交界處（1.6~2.8 mm），兩個(gè)濃度峰值存在明顯的差異。 攝藥后13 d，頭發(fā)中艾司唑侖濃度高峰區(qū)帶從發(fā)根端向發(fā)梢端移動(dòng)，分布于根部9.6~12.8 mm 內(nèi)，且在根部4 mm 頭發(fā)段內(nèi)未檢出艾司唑侖，表明藥物陽(yáng)性區(qū)帶已由毛根移至毛干。 同時(shí)，目標(biāo)物艾司唑侖的濃度雙峰現(xiàn)象也被邊界不清晰且寬度約為10 mm 的陽(yáng)性區(qū)帶所取代。本研究團(tuán)隊(duì)的另一項(xiàng)唑吡坦單劑量攝藥模型獲得了類(lèi)似的毛干目標(biāo)物分布結(jié)果。

圖6 單次攝藥后目標(biāo)物在單根毛發(fā)中的分布

本研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為目標(biāo)物濃度的雙峰現(xiàn)象揭示了毒（藥）物進(jìn)入頭發(fā)的途徑。 入體的毒（藥）物可通過(guò)兩種途徑進(jìn)入頭發(fā)：一是通過(guò)血液循環(huán)進(jìn)入毛囊后被毛基質(zhì)細(xì)胞吸收，在頭發(fā)毛干分布圖上表現(xiàn)為近根端的濃度高峰；二是通過(guò)汗腺和皮脂腺分泌浸潤(rùn)至真皮區(qū)域的毛干，在頭發(fā)毛干分布圖上表現(xiàn)為遠(yuǎn)根端的濃度小峰。 雙峰在毛干中的距離與發(fā)根端到頭皮的距離一致，而兩者的濃度值則反映了這兩種途徑對(duì)于毛干中目標(biāo)物的貢獻(xiàn)度。 然而，KUWAYAMA 等[7]的另一項(xiàng)研究顛覆了血液循環(huán)是所有毒（藥）物進(jìn)入毛干主要途徑的普遍認(rèn)知。 該研究者用微分段法研究了同時(shí)攝入的7 種藥物在單根頭發(fā)中的分布，觀察到7 種藥物的濃度-毛干分布特征呈現(xiàn)兩種類(lèi)型，其中依匹斯汀、非索非那定、氯苯那敏、去甲基氯苯那敏和雙氫可待因在單根毛干上呈現(xiàn)一大一小的雙峰分布，而甲基麻黃堿和麻黃堿在毛干上僅呈現(xiàn)一個(gè)主峰，且位于偏遠(yuǎn)端與真皮層進(jìn)入途徑相匹配的位置。這一發(fā)現(xiàn)表明，毒（藥）物進(jìn)入頭發(fā)的機(jī)制和途徑可能取決于其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)， 親脂性化合物主要通過(guò)血液循環(huán)進(jìn)入毛根， 而極性化合物則可能主要通過(guò)汗腺/皮脂腺途徑而非血液途徑。 目前，毒（藥）物在毛干上的分布特征與其化學(xué)性質(zhì)之間的關(guān)系尚未完全闡明，很難確定特定目標(biāo)物進(jìn)入頭發(fā)的主要途徑。 未來(lái)需要積累更多的毒（藥）物的分布特征數(shù)據(jù)，從而闡明毒（藥）物進(jìn)入頭發(fā)的一般機(jī)制和規(guī)律。

KAMATA等[26]為了研究藥物進(jìn)入頭發(fā)的機(jī)制，以甲氧那明為目標(biāo)物，將志愿者的單根頭發(fā)毛軸縱向切片，用基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-tandem mass spectrometry，MALDI-TOF-MS/MS）進(jìn)行成像，以驗(yàn)證單根頭發(fā)微分段的LC-MS/MS分布分析結(jié)果。 成像結(jié)果顯示，藥物攝入后首先大量集中于毛囊，僅有少量進(jìn)入頭發(fā)基質(zhì)，形成2~3 mm的獨(dú)特藥物帶，同時(shí)觀察到部分藥物進(jìn)入到真皮上部的角質(zhì)化毛干中，形成另一個(gè)約2mm的藥物帶，兩個(gè)藥物帶均隨著頭發(fā)的生長(zhǎng)向發(fā)梢端移動(dòng)。 MALDITOF-MS/MS的結(jié)果發(fā)現(xiàn)與LC-MS/MS分析結(jié)果一致。

上述所有研究結(jié)果提供了入體的毒（藥）物進(jìn)入頭發(fā)存在兩個(gè)途徑、兩個(gè)微區(qū)域的直接和直觀的證據(jù)。 然而這兩種途徑會(huì)導(dǎo)致毛干中目標(biāo)物的陽(yáng)性帶重疊，從而影響攝藥時(shí)間判斷的分辨率。 在評(píng)估頭發(fā)分析結(jié)果時(shí)應(yīng)考慮到這些因素。

2.3.3 頭發(fā)中毒（藥）物的來(lái)源判斷研究

頭發(fā)分析結(jié)果評(píng)判時(shí)需要關(guān)注的一個(gè)重要問(wèn)題是所檢陽(yáng)性結(jié)果系藥物攝入還是外部污染?對(duì)此通常采用頭發(fā)的去污染處理和分析目標(biāo)物的特征代謝物加以鑒別。 然而在某些條件下，目標(biāo)物的體內(nèi)代謝產(chǎn)物與體外分解物相同時(shí)，如可卡因可以轉(zhuǎn)化為苯甲酰愛(ài)康寧、海洛因可能轉(zhuǎn)化為嗎啡等，或當(dāng)使用劑量較低致頭發(fā)樣品中缺乏可測(cè)量的代謝物時(shí)，往往難以判斷目標(biāo)物的來(lái)源。 頭發(fā)MSA 技術(shù)雖然僅能給出毛干縱向目標(biāo)物的分布而無(wú)法給出毛干徑向的目標(biāo)物分布信息，但KUWAYAMA 等[27]認(rèn)為，根據(jù)頭發(fā)MSA 所得的目標(biāo)物濃度峰分布特征，可判斷頭發(fā)是否存在陽(yáng)性目標(biāo)物的外源性污染。

與MSA 技術(shù)不同，MALDI-MSI 技術(shù)可給出目標(biāo)物在單根頭發(fā)中空間分布的可視化信息，有可能進(jìn)一步區(qū)分陽(yáng)性目標(biāo)物系藥物攝入還是外部污染。本研究團(tuán)隊(duì)研究了采用MALDI-MSI技術(shù)判斷頭發(fā)中陽(yáng)性目標(biāo)物來(lái)源的可行性。 以DFSA案件唑吡坦陽(yáng)性頭發(fā)和唑吡坦溶液浸泡的頭發(fā)為研究對(duì)象， 單根頭發(fā)分別經(jīng)縱向切割后用優(yōu)化建立的MALDI-MSI方法進(jìn)行原位成像分析。 圖7顯示了唑吡坦陽(yáng)性頭發(fā)和唑吡坦浸泡頭發(fā)樣本中唑吡坦（m/z 308.17578，[M+H]+）的MS圖像和MS與光學(xué)重疊圖像，結(jié)果表明，唑吡坦陽(yáng)性頭發(fā)中目標(biāo)物分布于毛干內(nèi)部的髓質(zhì)和皮質(zhì)層，而唑吡坦溶液浸泡頭發(fā)中目標(biāo)物則主要分布于毛干表皮層，兩者存在顯著差異，該結(jié)果經(jīng)多根頭發(fā)驗(yàn)證，一致性良好。通過(guò)進(jìn)一步考察唑吡坦浸泡頭發(fā)經(jīng)常規(guī)去污清洗后目標(biāo)物的分布情況， 發(fā)現(xiàn)目標(biāo)藥物量雖有所減少但仍存在于毛干兩側(cè)。STOUT等[28]曾以小鼠為模型進(jìn)行結(jié)合機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)熒光素和羅丹明在毛發(fā)中的沉積與外部污染明顯不同。 與浸泡毛發(fā)時(shí)觀察到的藥物與角質(zhì)層結(jié)合相比，體內(nèi)沉積主要發(fā)生在髓質(zhì)和皮質(zhì)層。 上述研究表明，MALDIMSI技術(shù)可反映毛發(fā)中毒（藥）物的空間分布，為區(qū)分毒（藥）物攝入和外部污染，也為探究毒（藥）物在毛發(fā)中的進(jìn)入與結(jié)合機(jī)制提供可視化的支持。

圖7 唑吡坦陽(yáng)性頭發(fā)和唑吡坦浸泡頭發(fā)樣本中（m/z 308.17578，[M+H]+）MS 圖像和MS 與光學(xué)重疊圖像

2.3.4 毛根中毒（藥）物的動(dòng)力學(xué)研究

既往的分布研究多集中于頭發(fā)的毛干部位，而對(duì)于毒（藥）物進(jìn)入毛干的源部位（毛根）則少有觸及。 本研究團(tuán)隊(duì)曾以豚鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停竭M(jìn)行毛根與血液的毒物動(dòng)力學(xué)研究，建立毛根、毛干和血液中毒物分布的關(guān)聯(lián)[29-31]。在前期研究基礎(chǔ)上，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步利用MSA 技術(shù)考察4 名單次攝藥（艾司唑侖1 mg）志愿者單根頭發(fā)根部5 mm 頭發(fā)段內(nèi)艾司唑侖的分布及其動(dòng)力學(xué)模式。 研究結(jié)果顯示，攝藥30 min 后在毛根中檢出艾司唑侖，毛根中的艾司唑侖在1.92~4.8h（平均4h，n=24）區(qū)間內(nèi)達(dá)到濃度高峰（Tmax）（圖8）。艾司唑侖在受試者毛根和血液中的濃度-時(shí)間曲線(xiàn)相似，表明外源性物質(zhì)在毛根中的濃度與血液中的濃度具有關(guān)聯(lián)性。這與普遍認(rèn)為的外源性物質(zhì)經(jīng)過(guò)血液循環(huán)進(jìn)入頭發(fā)的認(rèn)知相一致。

圖8 單次攝藥后4 名受試者毛根中艾司唑侖濃度-時(shí)間分布曲線(xiàn)（n=6）

本團(tuán)隊(duì)研究結(jié)果同時(shí)顯示，攝入艾司唑侖后毛根中藥物半衰期平均為3.6 d（n=24）且在毛根中的檢測(cè)時(shí)限可達(dá)14 d。GUSTAVSON 等[32]對(duì)17 例健康男性受試者進(jìn)行的艾司唑侖血液藥代動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，單劑量（1 mg）攝入艾司唑侖后，血液中的艾司唑侖平均半衰期為14 h。 劉岳等[33]對(duì)24 名中國(guó)健康受試者進(jìn)行的藥代動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，單劑量（1 mg）攝入艾司唑侖后血液中艾司唑侖的平均半衰期為21~23 h。 顯然，毛根中艾司唑侖的代謝半衰期以及檢出時(shí)限明顯長(zhǎng)于血液。 筆者認(rèn)為，通過(guò)不斷對(duì)毛根蘊(yùn)含的潛在信息的挖掘，毛根有可能作為血液的補(bǔ)充檢材用于提供急性中毒的信息，尤其在血液缺失（如腐敗等）或毒物消除（如延緩死亡）的情形下，毛根可提供有價(jià)值的即時(shí)毒物暴露信息。

KUWAYAMA 等[34]為評(píng)估溺水尸體頭發(fā)中測(cè)量藥物分布的可能性，使用MSA 技術(shù)研究各種水溶液條件下頭發(fā)樣品中藥物的穩(wěn)定性。 結(jié)果在不含二價(jià)離子（Ca2+和Mg2+）的溶液中，隨著鹽濃度和浸泡時(shí)間的增加，頭發(fā)中的藥物含量減少了約5%；而在含有二價(jià)離子的溶液中，藥物含量的降低可忽略不計(jì)，即二價(jià)離子阻止了頭發(fā)中藥物的損失。 由于天然河流和海水中含有二價(jià)離子，故其認(rèn)為利用MSA研究藥物分布也可應(yīng)用于溺死尸體的毛發(fā)。

3 頭發(fā)微樣技術(shù)的局限性和應(yīng)用前景

頭發(fā)MSA 的方法策略和技術(shù)發(fā)展極大地拓展了毛發(fā)分析的證據(jù)能力和應(yīng)用價(jià)值。 在理論層面，通過(guò)精細(xì)表征毒（藥）物在毛干中的分布特征，以新的視角探析毛發(fā)中毒（藥）物的進(jìn)入和保留機(jī)制。 在實(shí)踐層面，通過(guò)精準(zhǔn)定位毛干中毒（藥）物的濃度高峰位，保障毛發(fā)分析對(duì)于攝毒時(shí)間和攝毒模式判斷的可靠性和精準(zhǔn)性，從而提升毛發(fā)分析的證據(jù)地位和應(yīng)用價(jià)值。然而，頭發(fā)MSA 作為一種新技術(shù)，仍存在適用范圍受限、方法局限性以及技術(shù)改進(jìn)等問(wèn)題。

頭發(fā)微分段的機(jī)械化和自動(dòng)化。 目前無(wú)論是采用機(jī)器切割法還是手動(dòng)切割法，頭發(fā)的毫米或亞毫米的分割以及后續(xù)轉(zhuǎn)移至提取管的操作仍是一個(gè)復(fù)雜、繁瑣、費(fèi)時(shí)的過(guò)程。KUWAYAMA 等[35]曾嘗試用電動(dòng)微操作器收取0.4mm 頭發(fā)片段并將其轉(zhuǎn)移到提取管，然而卻比手動(dòng)操作花費(fèi)了更多的時(shí)間。 此外，進(jìn)一步提高頭發(fā)分割的空間分辨率仍值得繼續(xù)探索。盡管頭發(fā)的縱向更細(xì)微的分段價(jià)值不大，但徑向分割或三維分割有助于研究外源性物質(zhì)的進(jìn)入和結(jié)合機(jī)制，提供外源性物質(zhì)是通過(guò)血循環(huán)或是通過(guò)汗液和皮脂腺滲透進(jìn)入毛發(fā)基質(zhì)之間差異的更詳細(xì)信息。

謹(jǐn)慎解釋MSA 分析結(jié)果。由于每根頭發(fā)基質(zhì)細(xì)胞的活性不同、所處生長(zhǎng)階段不同，故無(wú)論不同個(gè)體還是同一個(gè)體同一頭部區(qū)域的單根頭發(fā)間的毒藥物分布特征都可能存在一定的差異。 若兩根頭發(fā)間毒藥物的分布模式顯著不同，則可能該兩根頭發(fā)處于生長(zhǎng)周期的不同階段，故MSA 法必須通過(guò)獨(dú)立分析兩根或兩根以上的頭發(fā)獲得相似的分布結(jié)果才能進(jìn)行確認(rèn)。由于兩根頭發(fā)分析結(jié)果的匹配概率較低，大部分研究者認(rèn)同MSA 法應(yīng)收集5 根頭發(fā)。 其次，要評(píng)估單根頭發(fā)毒藥物分布特征可能受到頭發(fā)長(zhǎng)期暴露以及洗滌、陽(yáng)光、染發(fā)、燙發(fā)等自然和非自然因素的影響，謹(jǐn)慎解釋長(zhǎng)發(fā)發(fā)梢端毒物分布、峰值濃度下降以及可能出現(xiàn)的假陰性。再者，不同種族的頭發(fā)顏色和粗細(xì)存在顯著差異，而頭發(fā)中的黑色素對(duì)毒藥物的進(jìn)入和結(jié)合有很大影響。MIYAGUCHI 等[36]研究了日本人群黑色頭發(fā)和白色頭發(fā)中唑吡坦?jié)舛鹊牟町悾Y(jié)果日本人群黑發(fā)與中國(guó)人群黑發(fā)的唑吡坦?jié)舛认嗨疲h(yuǎn)高于白色頭發(fā)中的濃度。

MSA 方法的局限性。 值得注意的是，目前所有MSA 法研究的對(duì)象僅限于黑色頭發(fā)人群，其在白色頭發(fā)人群的適用性、可行性尚需要評(píng)估。 同理由于MSA 法的頭發(fā)樣本微量，需要關(guān)注難以進(jìn)入和結(jié)合于毛發(fā)基質(zhì)的中性、酸性藥物的可檢出性。 此外，目前研究結(jié)果表明，在攝藥時(shí)間估計(jì)方面采用內(nèi)部時(shí)間標(biāo)志物的精度更高，但在實(shí)踐中涉案者再次攝藥的可操作性存在一定難度。

如同所有的技術(shù)方法，MSA技術(shù)存在其特有的優(yōu)勢(shì)和局限。 但筆者認(rèn)為隨著MSA和MALDI-MS技術(shù)平臺(tái)的發(fā)展，聯(lián)合使用兩者可能會(huì)更好地解決攝毒模式和攝毒時(shí)間判斷，以及闡明毒藥物進(jìn)入機(jī)制的難題。