山東漢族人群37個Y-STR基因座多態性與突變調查

郭科建，黃磊，李士林，殷才湧，湯真

1.山東省淄博市公安司法鑒定中心，山東 淄博 255000；2.復旦大學生命科學學院 上海 200092；3.山東省公安廳物證鑒定研究中心，山東 濟南 250031

Y 染色體具有男性特有、父系遺傳的特點，相比常染色體遺傳標記有其獨特的優點。Y-STR 具有非重組、單倍型父系遺傳的特征，近年被廣泛應用于家系排查、混合斑男性成分檢測檢驗中，已成為公安機關偵破案件的重要手段之一[1]。Y 染色體分為擬常染色體區和非重組區，擬常染色區常與X 染色體發生重組，非重組區不發生重組，法醫Y-STR 基因座的挑選多分布于非重組區，呈單倍型遺傳，且多含有重復序列，在遺傳過程中，極易發生突變，突變率約為4×10-3[1-3]。本研究通過采集山東省16 個地級市1 490 個家系祖孫三代人的樣本，進行遺傳多態性和突變率分析，以發現家系內部的遺傳突變規律，為山東省Y-STR 數據的應用比對和國產試劑盒的研發提供遺傳學基礎數據。

1 材料與方法

1.1 樣本

山東省16 個地級市選擇1 490 個漢族家系，分別為濟南97 個、青島104 個、淄博178 個、棗莊92 個、東營60個、煙臺125個、濰坊93個、濟寧118個、泰安78個、威海44個、日照60個、臨沂82個、德州88個、聊城80個、濱州97 個、菏澤94 個，每個家系采集祖孫三代5 份血液樣本，分別為“爺爺” “父1”“父2”“子1”“子2”，其中“父1”和“父2”均為“爺爺”的兒子，“子1”為“父1”的兒子，“子2”是“父2”的兒子，均通過常染色體檢驗確定親子關系，要求家系之間無任何親緣關系，并在當地居住5 代以上。在簽署知情同意書的基礎上使用經典型血樣采集卡（長春市博坤生物科技有限公司）采集人員樣本。共計5 960 對父子，7 450 份樣本。本研究通過復旦大學倫理委員會生物醫學研究項目倫理審批[審批號：復倫研批（FE22025R）號]。

1.2 方法

上述7 450 份樣本，均使用1.0 mm DNA 手工打孔取樣器（北京華興瑞安科技有限公司）取樣。使用SureID?PathFinder Plus 擴增熒光檢測試劑盒（寧波海爾施基因科技股份有限公司），反應體系為10 μL，包含4 μL 反應混合物，2 μL 引物混合物，4 μL 超純去離子水，1.0 mm 血 卡。在9700 型PCR 儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）上進行擴增。PCR 程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，70 ℃ 30 s，28 個循環；60 ℃ 15 min；4 ℃保存。使用3500xL 基因分析儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）進行檢測，GeneMapperTMID-X 軟 件v1.6（美 國Thermo Fisher Scientific 公司）對37 個Y-STR 基因座等位基因分型數據進行分析。按照《人類DNA 熒光標記STR 分型結果的分析及應用》（GA/T 1163—2014）要求，對分型、峰值達不到標準的樣本重新檢驗，最終達到要求。觀察到異常基因分型的樣本，用Yfiler Platinum PCR擴增試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific 公司）進行驗證。

1.3 數據統計

采用直接計數法對1 490 個家系中標記為“爺爺”的Y-STR 數據進行統計。計算37 個基因座中每個基因座的基因頻率、單倍型頻率、GD、HD 和DC[4]。多拷貝基因座用單倍型頻率代替基因頻率。

采用直接計數法統計上述5 960 對父子間遺傳傳遞中各基因座的突變次數、基因型傳遞次數、一步突變和多步突變次數等。按照基因座突變率=某基因座突變次數/基因型傳遞次數[5]、家系突變概率=突變家系的數量/總家系數、父子突變概率=突變父子對的數量/總父子對數、回復突變率=回復突變次數/（總家系數×2×37），分別計算基因座突變率、家系突變概率、父子突變概率和回復突變率。根據網站https：//statpages.info/confint.html 的方法計算95%置信區間（confidence interval，CI）。

2 結果

2.1 遺傳多態性

1 490 個家系中標記為“爺爺”的樣本37 個YSTR 基因座（包含4 個雙拷貝基因座）共檢出1 490 種單倍型，總體HD 值和DC 值均為1。37 個Y-STR 基因座共檢出368 個等位基因，GD 值排名前四的基因座是4 個雙拷貝基因座[DYS385（0.966 8）、DYF387S1（0.953 6）、DYF387S1（0.953 7）和DYS527（0.944 4）]，GD 值最低的基因座為DYS645（0.103 2），該基因座的等位基因“.8”占比高達94.6%。37 個Y-STR 基因座單倍型分布見附表1，GD 值見表1。

表1 山東省漢族男性人群37 個Y-STR 基因座GD 值Tab.1 GD values of 37 Y-STR loci in Shandong Han male population（n=1 490）

在DYF387S1、DYS627、DYS518等15 個基因座上觀察到33種92次微變異等位基因（表2），其中：“.2”出現74次，占80.4%；“.1”和“.3”分別出現8次和10次，分別占8.7%和10.9%。DYS627微變異等位基因種類最多，有6 種，DYS518微變異等位基因出現頻次最高，達49次。此外，在DYS19、DYS437、DYS439等9個單拷貝基因座上觀察到11 次雙等位基因，平均概率為2.24×10-4，其中，DYS19為14/15 和15/16，DYS437為14/15，DYS439為11/13，DYS458為17/19.2，DYS518為36/37、DYS570為18/19、DYS576為18/20、DYS593為14.3/16、DYS643為10/11 和11/12。在DYF387S1、DYF404S1、DYS385、DYS527共4 個雙拷貝基因座上觀察到86 次多等位基因現象，平均概率為1.44×10-2，其中，DYS385觀察到3等位基因2次，4等位基因1次；DYF404S1觀察到3等位基因16次；DYF387S1觀察到3等位基因41次，4 等位基因1 次；DYS527觀察到3 等位基因22 次，4 等位基因3 次。DYS447在3 個樣本上出現空等位基因，而相鄰的DYS456和DYS444出現雙等位基因，經過Yfiler Platinum PCR 擴增試劑盒驗證發現，DYS447等位基因并未缺失，是因為這3個樣本DYS447的等位基因分型分別為16、30.3和32.2，均超出了本研究所用試劑盒該基因座bin 的范圍（17～30），但未超出驗證試劑盒的bin 的范圍（16～33），等位基因落在了臨近的基因座上。

表2 微變異等位基因分布表Tab.2 Distribution of microvariant allelic loci

2.2 等位基因突變

37 個Y-STR 基因座及其突變情況見表3，從表中可以看到，5 960 對父子對共檢出220 520 次基因型傳遞，共檢測到922 次等位基因的突變，平均突變率為4.2×10-3（95%CI 3.9×10-3～4.5×10-3）。突變發生在35 個基因座上，其中突變率最高的基因座是DYS576，突變率為16.4×10-3（95%CI 13.4×10-3～20.0×10-3），突變率最低的基因座是DYS596，突變率為0.2×10-3（95%CI 0～0.9×10-3）；DYS438、DYS645基因座未發現突變。

表3 山東省人群37 個Y-STR 基因座的突變情況Tab.3 Mutations of 37 Y-STR loci in Shandong population

本研究1 490個家系中，發生突變的家系有668個，占44.8%，其中，518 個家系有一對父子發生突變，占77.5%，130 個家系兩對父子發生突變，占19.5%，19 個家系有3對父子發生突變，占2.8%，1個家系中4對父子全都有突變，占0.15%，該家系突變全都發生在DYS19，分別為爺→父1（16→15），爺→父2（16→15），父1→子1（15→16），父2→子2（15→16）。在檢測出的922次等位基因突變中，一步突變發生了881次，占總突變數的95.6%，兩步突變17次，占總突變數1.8%，重復單位增加有447次（49.8%），重復單位減少有451次（50.2%），等位基因丟失出現了24次，占突變總數的2.6%。5 960對父子中，有839對發生突變，占14.12%。其中，756對父子發生單基因座突變，占90.11%，74對父子發生雙基因座突變，占8.82%，9對父子發生三個基因座突變，占1.1%，這9對父子中有4對同時在DYS527、DYF404S1、DYF387S1發生缺失突變。

本研究共在6 個基因座上觀察到10 次回復突變，分別出現在9個家系中，其中家系3出現兩次回復突變（表4）。1 490個家系中每個家系都有兩次三代等位基因傳遞，平均回復突變率為10/（2 980×37）=9.07×10-5。

表4 回復突變情況統計Tab.4 Statistics of revertant mutation

3 討論

本研究收集的樣本范圍廣、數量大，可以代表山東省漢族人群的真實情況，科學反映山東漢族人群的Y-STR 遺傳規律。以家系為單位，采集三代人的樣本，除了得出父子間等位基因突變率，也研究了家系突變率和回復突變。

本研究結果顯示，1 490個山東漢族男性家系中，標記為“爺爺”的男性個體37個Y-STR基因座的HD值與DC 值均為1，說明該37 個基因座完全可以將山東省內任何兩支無關家系區分開，能夠滿足法醫實際工作需要。但是，個別基因座如DYS645，盡管其突變率為0，極其穩定，但GD 值僅0.103 2，極差的多態性削弱了其法醫學實用價值。某些基因座的遺傳多態性呈現明顯的南北和民族差異，DYS389Ⅰ和DYS388在貴州三都水族的GD 值分別為0.124[6]和0.063 1[7]，而他們在山東人群中的GD值分別為0.623 8和0.509 7。

本研究涉及的37 個基因座中，發現92 次微變異等位基因，這些等位基因在群體中的頻率比較低。該變異的出現與等位基因的突變引起重復序列中核苷酸的缺失、插入、轉換或者顛換有關[8]。另外，還有單拷貝基因座出現雙等位基因，雙拷貝基因座出現多等位基因，這可能是Y 染色體減數分裂過程中，同源染色體部分發生重組互換或基因座高度多態性造成[9-10]。通過觀察上述特殊分型，他們的產生可以形成更多的單倍型，并且遵循孟德爾遺傳定律，可以遺傳給后代[11]，在法醫學應用實踐中有著非常重要的作用。DYS447出現空等位基因，經驗證發現，是試劑盒bin 的范圍不同導致，提示法醫工作者采用試劑盒互相驗證的重要性。

5 960對父子對共發現922次基因突變，平均突變率為4.2×10-3，與湖南漢族3.6×10-3[1]、廣東漢族4.4×10-3[2]、中國漢族4.1×10-3[3]相差不大。參照文獻[12]，將突變率大于10×10-3的基因座歸為快速突變基因座，本研究中采用的試劑盒有DYF387S1、DYF404S1、DYS449、DYS518、DYS570、DYS576和DYS627共7 個快速突變基因座。但本研究發現，只有DYS576、DYS627、DYS518、DYS449在山東人群的突變率超過10×10-3，達到快速突變標準，DYF387S1、DYF404S1和DYS570未達到10×10-3，表明某些基因座突變率存在明顯的人群差異。

922 次突變中，兩步以內突變概率為97.4%，符合逐步突變模型[13]（step-wise mutation model，SMM）猜想，等位基因增加與減少比例為447∶451，表明基因突變方向的隨機性。本研究839 對突變的父子對中，90.11%發生在單個基因座上，未發現三個基因座以上突變。吳微微等[14]研究也表明，中國漢族同一家系男性成員之間，Y-STR 分型的容差局限在一定范圍，35 個Y-STR 分型容差多在3 個基因座，3 步突變以內。在觀察到的9 對3 個基因座同時突變的父子中，有4 對在DYS527、DYF404S1、DYF387S1共3 個基因座同時發生丟帶，推測可能是因為這3個快速突變基因座的第二個拷貝均位于Y 染色體非重組區Yq11.23 區域，三者物理距離較近，在減數分裂時，該片段發生整體缺失導致，曾有報道[15]同樣的現象也發生于Amelogenin、DYS456、DYS570及DYS576這4 個基因座。試劑盒的開發者也要考慮到這個問題，同一款試劑盒中盡量選擇物理位置相對較遠的基因座。

回復突變指的當基因突變再次發生時，又恢復成原來的基因。回復突變體現了基因突變的不定向性。回復突變在法醫DNA 領域研究較少，其存在使家系內部的突變研究變得復雜，也讓隔代突變的研究失去意義。本研究中，9.07×10-5的回復突變率雖然不高，但是在家族內部漫長的遺傳過程中，會出現明顯的疊加效果。

根據本研究結果，三代之內近45%的家系突變率和14%的父子突變率，對法醫DNA 從業人員進行數據比對提出了巨大挑戰，大大增加辦案難度。同時，幾十年后，隨著數據庫中有STR 分型數據的人員相繼去世，數據庫利用價值將大打折扣，如何長期有效地利用巨資搭建起來的數據庫，是每一名法醫DNA 檢驗人員需要認真考慮的問題。

綜上所述，本研究獲得了山東省人群37 個YSTR 基因座的遺傳多態性數據和突變情況，為山東的Y-STR 數據庫建設與法醫學應用提供了重要的遺傳學基礎數據，給基層辦案人員使用Y-STR 數據提供了參考，也為國產試劑盒的開發提供了思路和部分基礎數據。