基因多態性對丙戊酸鈉及代謝物血藥濃度的影響及其與不良反應的相關性研究*

顧瀾婷，王雨萍，陸韻竹，許倍銘，陳 冰

上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院 藥劑科，上海 200025

丙戊酸鈉（valproic acid，VPA）是治療癲癇經典藥物，治療窗較窄，治療藥物監測（therapeutic drug monitoring，TDM）常用于VPA 臨床治療，有效血藥濃度范圍為50～100 μg·mL-1[1]。多數患者服用VPA較為安全，但仍有不良反應發生，其中肝毒性是最需警惕的不良反應，因此需要定期檢查肝功能[2]。研究報道肝功能損傷的不良反應可能與其代謝過程相關，VPA 在體內經過不同代謝途徑，形成50 多種代謝物，其中2-丙基-2-戊烯酸（2-propyl-2-pentenoic acid，2-ene-VPA）是VPA 主要的代謝產物，在體內經線粒體β 氧化產生，具有抗癲癇活性，同時也可能導致胰腺炎和高氨血癥等不良反應[3]；2-丙基-4-戊烯酸（2-propyl-4-pentenoic acid，4-ene-VPA）可能是與肝毒性相關的主要代謝物之一[4]。同時研究表明[5]，VPA 的部分不良反應發生與遺傳因素有密切關系，可能與肝功能損傷相關的基因包括細胞色素 P450 2C9（cytochrome P450 2C9，CYP2C9）、尿苷葡萄糖醛酸轉移酶（uridine glucuronate transferase，UGTs）、氨甲酰磷酸合酶1（carbamoyl phosphate synthetase 1，CPS1）、線粒體聚合酶（mitochondrial polymerase gamma，POLG）、過 氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）等，其中CYP2C9、UGTs 在VPA 代謝中具有重要作用。本文研究基因多態性對中國人群中VPA 及其代謝物血藥濃度的影響，并探討后者與肝功能損傷之間的關系，以期為制定中國人群個體化的VPA 藥物治療方案、避免不良反應發生提供依據。

1 一般資料

納入2022 年12 月～2023 年5 月于我院診斷為癲癇的患者共99 人，其中男性60 人，女性39 人，年齡（52.72±20.91）歲（7～95 歲），體重（64.36 ±14.73）kg，服用丙戊酸鈉片（200 mg ∶100 片/瓶，湖南省湘中制藥有限公司）、丙戊酸鈉緩釋片[0.5 g ∶30片/瓶，賽諾菲（杭州）制藥有限公司]或丙戊酸鈉口服溶液[12 g ∶300 mL/瓶，賽諾菲（杭州）制藥有限公司]，服用劑量為300～1600 mg·d-1,用法用量個體化差異大，部分為800 mg bid、200 mg tid、200 mg bid、400 mg tid、400 mg bid、早200 mg 晚100 mg 等。患者常規進行VPA 濃度監測，共收集常規TDM 和剩余樣本144 份，其中檢測1 次、2 次、3 次及以上分別為65、25、9 人。

2 主要儀器

3730XL 型DNA 序列檢測儀（美國賽默飛ABI公司）；API4000 型三重四級桿質譜儀（美國Applied Biosystems 公司）；UFLC 色譜系統（日本島津公司）；5804R 臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）。

3 方 法

3.1 標本采集

患者采集血樣前，血藥濃度已達到穩態（VPA半衰期為7～10 h，經過4～5 個半衰期），于次日早晨服藥前靜脈采血3 mL，分離上層血清于-20℃保存，用于VPA 及其代謝物血藥濃度檢測；同時下層血凝塊部分用于提取DNA 并基因檢測。通過我院信息系統收集監測當日患者肝功能指標。

3.2 VPA 及代謝物血藥濃度檢測

精密吸取血清樣本100 μL 至1.5 mL 離心管中，采用LC-MS/MS 法檢測患者VPA 及代謝物2-ene-VPA、4-ene-VPA 血藥濃度，檢測方法參考文獻[6]并作修改，采用Agilent Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×50 mm，5 μm）分離；流動相A 相為5 mmol·L-1甲酸銨-0.1%甲酸水溶液，B 相為0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫：0～0.5 min，20% B；0.5～6 min，20%→85%B；6～6.5 min，85%→95%B；6.5～7 min，95% B；7～9.1 min，95%→20% B；7.1～10 min，20% B；流速0.30 mL·min-1；柱溫40℃。采用電噴霧離子化電離源（electron spray ionization，ESI），負離子方式檢測，多重反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）定量。試驗回收率、精密度標準偏差均小于15%，穩定性良好。在分析基因多態性對血藥濃度的影響時，為消除患者體重與服藥劑量對血藥濃度的影響，將所得血藥濃度除以體重與服藥劑量，得到單位體重劑量的校正血藥濃度。

3.3 基因檢測

從血樣中提取DNA，設計不同長度的引物SNaPshot 反應后，檢測多個SNP 位點，詳見表1。DNA 樣本取1 μL 稀釋到工作濃度5～10 ng·μL-1，引物稀釋到工作濃度50 μmol·L-1。多重PCR 反應：4 μL 擴增引物Premix，10 μL ExTaq（HS），2 μL DNA，4 μL H2O，反應條件為95℃2 min 后，95℃20 s，65°（TD-0.5/C）40 s，72℃1 min，共12 個循環，然后95℃20 s，59℃30 s，72℃1 min，共24 個循環后72℃10 min，在4℃保存。PCR 產物純化：在15 μL PCR 產物中加入5 U SAP 酶和2 U Exonuclease Ⅰ酶，37℃溫浴1 h，75℃滅活15 min。SNaPshot 延伸反應：5 μL SNaPshot Multiplex Kit（ABI），2 μL 純化后多重PCR 產物，1 μL 延伸引物Premix，2 μL H2O，反應條件為95℃10 s，然后95℃10 s，50℃5 s，60℃30 s，共35 個循環，60℃30 s，在4℃保存。基因型分析采用ABI 3730XL 測序儀基因測序儀完成，利用GeneMapper 4.0（Applied Biosystems Co.，Ltd.，USA）軟件分析數據。采用直接測序法檢測UGT2B7 rs12233719、UGT1A6 rs2070959 兩個位點。

表1 基因多態性位點引物序列

3.4 統計學處理

數據采用SPSS 24.0 軟件分析，Hardy-Weinberg 定律檢驗等位基因型頻率是否具有符合遺傳規律，計數資料以“%”表示，計量資料以（）表示，采用單因素ANOVA 檢驗或獨立樣本t 檢驗進行比較。相關性研究采用皮爾遜相關分析，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

4 結果

4.1 一般資料

99 位患者VPA、2-ene-VPA、4-ene-VPA 血藥濃度詳見表2。根據年齡、性別分組均無統計學差異（P ＞0.05）。

表2 99 位患者年齡與VPA 及其代謝血藥濃度的值（）

表2 99 位患者年齡與VPA 及其代謝血藥濃度的值（）

4.2 基因型及等位基因分布頻率

99 位患者UGT2B7（rs12233719、rs7668258）、UGT1A6（rs2070959、rs1105879、rs89910）、CAT rs1001179、CPS1 rs1047891、SOD2 rs4880 基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg 平衡,差異均無統計學意義（P ＞0.05），見表3。3 位患者未檢測到rs7668258 位點，3 位患者未檢測出rs3087374 位點，可能存在位點缺失；CYP2C9 rs1057910 在檢測人群中均為AA 型，無統計學意義，因此未列入后續分析。

表3 99 位患者候選基因的基因型與等位基因分布頻率[n（%）]

4.3 藥物代謝酶基因多態性與VPA、2-ene-VPA、4-ene-VPA 校正血藥濃度

99 位患者基因多態性與校正血藥濃度的結果詳見表4。UGT2B7 rs7668258 TT 型患者2-ene-VPA 校正血藥濃度低于CC/CT 型（P ＜0.05）；UGT1A6 rs89910 CT 型患者VPA、2-ene-VPA 校正血藥濃度顯著高于CC 型患者（P ＜0.05），其余基因型與濃度之間差異無統計學意義（P ＞0.05）。結果表明UGT1A6、UGT2B7 基因多態性可能影響VPA 代謝物濃度。進一步研究發現，根據UGT1A6 rs89910基因型分組，UGT2B7 rs7668258 不同基因型之間差異無統計學意義（P ＞0.05）。

表4 99 位患者候選基因的基因型與等位基因分布頻率[n（%）]

4.4 VPA 及代謝物水平、基因多態性對肝功能的影響

本研究未發現肝功能損傷的患者，采集反映肝功能的指標，包括谷氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（as-partate aminotransferase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBIL），探索其與VPA、2-ene-VPA、4-ene-VPA 血藥濃度的關系。結果（表5）表明VPA 與ALT、AST、ALP 水平相關，而4-ene-VPA 與ALT 相關。進一步研究基因多態性與肝功能指標是否存在相關性，將肝功能指標根據基因多態性進行分組檢驗，結果顯示，CPS1 rs1047891 CC 型ALT、ALP 水平顯著低于AA/AC 型患者，CC型與AA/AC 型患者的ALT 分別為（27.86±23.23）和（46.54±51.26）U·L-1（P=0.033）；ALP 分別為（79.41±31.37）和（97.83±47.28）U·L-1（P=0.049）。

表5 VPA、2-ene-VPA、4-ene-VPA 血藥濃度與肝功能指標的關系

5 討論

已有研究發現VPA 的肝功能損傷與其代謝過程及相關酶基因多態性有關。VPA 在體內主要有3條途徑代謝：①線粒體的β-氧化途徑，主要生成2-ene-VPA 等，約占代謝過程的40%；②細胞色素P450 氧化代謝途徑，經CYP2C9 等代謝，主要生成4-ene-VPA；③UGT 是Ⅱ相代謝途徑，通過UGT1A6、UGT2B7 等同功酶代謝生成親水性的葡萄糖醛酸丙戊酸代謝物[7]。VPA 氧化代謝消耗體內抗氧化物質，并能抑制線粒體β-氧化，導致活性氧簇大量積聚，加重肝細胞損傷壞死，可能是VPA 誘導肝毒性的重要原因，而UGT 催化生成Ⅱ相代謝物經腎臟排出體外，可以發揮解毒作用。不同藥物代謝酶基因多態性可能影響VPA 及代謝物濃度水平，進而與肝功能損傷等不良反應相關。PharmGKB 數據庫 將rs12233719、rs7668258、rs2070959、rs1105879、rs89910、rs3087374、rs1001179、rs4880、rs1057910、rs1047891 基因與VPA 的肝臟毒性聯系判定為3級，而相關研究在中國患者中開展較少。

本研究發現，對于患者體內的VPA 及其代謝物血藥濃度，性別與年齡并不是其影響因素（P ＞0.05）。UGT 基因型對VPA 及其代謝物濃度具有影響，UGT2B7 rs7668258 CC/CT 組患者2-ene-VPA校正血藥濃度顯著高于TT 組（P ＜0.05）；UGT1A6 rs89910 CT 型患者VPA、2-ene-VPA 校正血藥濃度則均顯著高于CC 組患者（P ＜0.05）。前期研究表明[8]，兒童UGT1A6 基因多態性與VPA 的濃度和耐受性方面的臨床結果無明顯相關性。造成差異性的原因可能是兒童UGTs 表達低于成人，使基因多態性對VPA 的影響被相互作用等情況掩蓋[9]。本研究發現UGTs 在VPA 的代謝中發揮了重要作用，在UGTs 活性強的情況下，更多VPA 經Ⅱ相代謝，相應減少氧化途徑代謝，在長期應用的情況下，患者VPA 代謝物在體內蓄積減少，可能進一步影響VPA的療效與不良反應的發生[10，11]。

AST、ALT、ALP、DBIL、TBIL 是臨床反映肝臟功能的常規指標。本次研究結果表明，VPA 血藥濃度與AST、ALT、ALP 相關，4-ene-VPA 血藥濃度與ALT 具有一定相關性，結果與前期報道一致[12]，VPA與代謝物4-ene-VPA 可能是VPA 所致肝功能損傷的原因。本研究未發現肝功能嚴重損傷患者，大多數患者肝功能指標也在正常范圍，可能是研究結果相關系數較低的原因。本次研究也進一步探索了基因多態性與VPA 所致肝功能損傷之間的相關性，結果發現，CPS1 rs1047891 CC 型與AA/AC 型患者相比，兩組在ALP、ALT 水平均具有顯著差異。CPS1表達于肝臟線粒體內，是催化尿素循環第一步反應，使肝臟發揮解毒功能的關鍵酶之一，CPS1 rs1047891 CC 型患者解毒能力強，AA/AC 型患者比CC 型患者更容易引起VPA 的肝功能損傷，但是其影響的機制還有待進一步證明。

研究報道CAT rs1001179 在健康組和肝功能異常組中基因多態性也存在顯著差異[13]，POLG 在細胞中發揮mtDNA 合成和修復作用，其突變與VPA 誘導的肝毒性有直接關系[14]。本次研究中未證實兩者與肝功能指標的相關性。原因可能包括：①這些基因多態性與肝功能相關，但可能并非是VPA引起肝功能改變的特異指標；②本研究納入的患者中未發生嚴重肝功能損傷，POLG、CAT 等基因多態性的影響未能充分體現。此外，本研究未將合并用藥作為影響因素研究，具有一定局限性，后期需進一步擴大患者樣本量，充分考察各方面因素的影響。

本次研究初步探討了基因多態性對丙戊酸鈉及代謝物血藥濃度的影響及其與不良反應的聯系，發現UGT1A6、UGT2B7 基因多態性與VPA 代謝物2-ene-VPA 水平相關；VPA 及其代謝物4-ene-VPA可能影響肝功能指標，CPS1 rs1047891 基因多態性影響ALT、ALP 水平，VPA 及代謝物濃度及基因多態性可能是肝臟損傷的原因。在進一步研究基礎上，建立VPA 及其代謝物與基因多態性與肝功能損傷更加明確的關系，為VPA 患者提供更安全、更科學的個體化治療方案。