款冬花多糖磁性納米粒的制備工藝研究

葉世莉,劉思美,張麗華,張婷婷,郭 可,趙 鵬*

(1.陜西中醫藥大學 陜西中藥基礎與新藥研究重點實驗室,陜西 咸陽 712000;2.陜西國際商貿學院,陜西 咸陽 712000)

款冬花是我國傳統中藥材,為植物款冬(TussilagofarfaraL.)的干燥花蕾,具有潤肺止咳、化痰平喘之功效,常用來治療慢性支氣管炎、咳嗽氣喘等疾病[1]。款冬花多糖(TussilagofarfaraL.polysaccharides,TFP)具有明顯的抗腫瘤、調節機體免疫、抗氧化等生物活性[2-5]。隨著納米技術的迅速發展,納米藥物逐漸應用于疾病的治療[6-12],受到人們的廣泛關注。基于此,作者以款冬花多糖為原料,將其與Fe3O4納米粒子超聲反應制備款冬花多糖磁性納米粒,以款冬花多糖磁性納米粒粒徑和分散系數(PDI)[13]為考察指標,在單因素實驗的基礎上,運用Box-Behnken響應面法[14-16]優化款冬花多糖磁性納米粒制備工藝,擬為款冬花多糖的進一步應用[17]提供一定的研究基礎。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

款冬花,購于陜西省西安市萬壽路藥材市場,經陜西中醫藥大學王國全教授鑒定為菊科植物款冬(TussilagofarfaraL.)的干燥花蕾。

1,10-菲啰啉(鄰二氮菲)、乙醇、抗壞血酸(VC)、醋酸鈉、苯酚、六水合氯化鐵(FeCl3·6H2O)、七水合硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)、濃氨水等均為分析純;去離子水(娃哈哈純凈水);KBr,光譜純。

UV-DS5型紫外可見分光光度計;KQ-500DE型超聲波清洗器,昆山超聲儀器有限公司;Nano-ZS ZEN3600型納米粒度儀;FA1004型電子天平,上海舜宇恒平科學儀器有限公司;T-27型傅立葉變換紅外光譜儀,德國布魯克分析儀器公司;OSB-2100型旋轉蒸發器,上海愛郎儀器有限公司。

1.2 款冬花多糖的制備

參照文獻[1]方法,精密稱取少許干燥款冬花,用95%乙醇進行脫脂處理后,按一定料液比加入80 ℃的熱水提取2次,合并濾液,經旋蒸減壓濃縮;采用 Sevage法脫去蛋白、大孔樹脂法脫色,經Sephadex G-100凝膠柱純化,洗脫液透析并醇沉,冷凍干燥,即得款冬花多糖。

1.3 款冬花多糖磁性納米粒的制備

參照文獻[18-19]方法并稍作改進,采用分步法制備款冬花多糖磁性納米粒。

按質量比2∶1精密稱取FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O,溶于去離子水中,800 r·min-1攪拌使其混合均勻;將混合物加熱至70 ℃,加入適量的濃氨水調節pH值至9～10,溶液迅速變為黑色;氮氣保護下反應3 h,冷卻至室溫,用外磁體將納米粒子分離出來,用去離子水洗滌3次后,置于45 ℃真空干燥箱中干燥24 h,即得Fe3O4納米粒子,備用。

將一定量的Fe3O4納米粒子置于250 mL圓底燒瓶中,加入去離子水,在一定溫度、功率下超聲處理使其分散均勻;稱取一定量干燥的款冬花多糖溶于去離子水中,置于滴液漏斗中,滴入上述Fe3O4納米粒子溶液中,滴加結束后,在一定功率下繼續超聲一定時間,用外磁體將納米粒子分離出來,用500 mL去離子水洗滌3次后,置于60 ℃真空干燥箱中干燥,即得款冬花多糖磁性納米粒。

1.4 款冬花多糖磁性納米粒的制備工藝優化

采用單因素實驗分別考察m(款冬花多糖)∶m(Fe3O4納米粒子)(1∶0.5、1∶0.75、1∶1.0、1∶1.25、1∶1.5)、超聲時間(20 min、25 min、30 min、35 min、40 min)、超聲功率(250 W、300 W、350 W、400 W、450 W)對款冬花多糖磁性納米粒粒徑和PDI的影響。

在單因素實驗的基礎上,選取m(款冬花多糖)∶m(Fe3O4納米粒子)、超聲時間、超聲功率為考察因素,以款冬花多糖磁性納米粒的粒徑和PDI為考察指標,進行Box-Behnken響應面實驗,進一步優化款冬花多糖磁性納米粒的制備工藝。

1.5 款冬花多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定款冬花多糖含量。先繪制葡萄糖標準曲線[17,20],擬合得線性方程:y=7.4621x+0.0633,R2=0.9971。葡萄糖含量在0.01～0.1 mg·mL-1范圍內與吸光度線性關系良好。

精密吸取款冬花多糖溶液0.2 mL,加入蒸餾水至1.0 mL,加入1.0 mL現配的5%苯酚溶液,搖勻;加入5.0 mL濃硫酸,搖勻,靜置5 min,沸水浴15 min,冷卻至室溫;不加款冬花多糖溶液,同法操作,作為空白對照,測定490 nm處吸光度,計算款冬花多糖含量。

1.6 鐵含量的測定

采用鄰二氮菲法測定款冬花多糖磁性納米粒中的鐵含量[21-22]。精密稱取400.8 mg六水合硫酸亞鐵銨置于250 mL容量瓶中,加去離子水溶解并定容至濃度為0.2 mg·mL-1;以抗壞血酸(100 g·L-1)為還原劑,制備一系列鐵標準溶液;將一系列鐵標準溶液分別加入50 mL容量中,加入100 g·L-1抗壞血酸2 mL、0.15%鄰二氮菲溶液2 mL、1 mol·L-1醋酸鈉溶液5 mL,定容,測定510 nm處吸光度。以Fe3+濃度(μg·mL-1)為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線,擬合得線性方程:y=0.1728x+0.0568,R2=0.9910。

精密稱取50 mg款冬花多糖磁性納米粒置于燒杯中,加入適量的濃鹽酸,水浴加熱,待完全呈液體狀后,移至100 mL容量瓶中,加去離子水定容至刻度;精密吸取1 mL上述溶液,移至50 mL容量瓶中,按上述方法測定510 nm處吸光度,計算鐵含量。

1.7 理化性質分析

1.7.1 紅外光譜分析

分別稱取一定量的款冬花多糖、Fe3O4納米粒子及款冬花多糖磁性納米粒,與經過干燥脫水的KBr進行混合研磨、壓片,置于紅外光譜儀中進行掃描,掃描范圍為4 000～400 cm-1。

1.7.2 粒徑分析

精密稱取適量款冬花多糖磁性納米粒樣品,加入適量蒸餾水,超聲分散,采用納米粒度儀測定粒徑。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1m(款冬花多糖)∶m(Fe3O4納米粒子)的影響

固定超聲時間為40 min、超聲功率為400 W,考察m(款冬花多糖)∶m(Fe3O4納米粒子)對款冬花多糖磁性納米粒粒徑和PDI的影響,結果見圖1。

圖1 m(款冬花多糖)∶m(Fe3O4納米粒子)對款冬花多糖磁性納米粒粒徑和PDI的影響Fig.1 Effect of m(TFP)∶m(Fe3O4 nanoparticles) on particle size and PDI of magnetic nanoparticles of TFP

由圖1可知,隨著Fe3O4納米粒子用量的增加,款冬花多糖磁性納米粒的粒徑和PDI均逐漸減小,當m(款冬花多糖)∶m(Fe3O4納米粒子)為1∶1.0時,粒徑和PDI均最小;繼續增加Fe3O4納米粒子用量,粒徑和PDI均逐漸增大。因此,m(款冬花多糖)∶m(Fe3O4納米粒子)以1∶1.0為宜。

2.1.2 超聲時間的影響

固定m(款冬花多糖)∶m(Fe3O4納米粒子)為1∶1.0、超聲功率為400 W,考察超聲時間對款冬花多糖磁性納米粒粒徑和PDI的影響,結果見圖2。

由圖2可知,隨著超聲時間的延長,款冬花多糖磁性納米粒的粒徑和PDI均逐漸減小,當超聲時間為30 min時,粒徑和PDI均較小;進一步延長超聲時間,粒徑和PDI均變化不大。因此,超聲時間以30 min為宜。

圖 2 超聲時間對款冬花多糖磁性納米粒粒徑和PDI的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on particle size and PDI of magnetic nanoparticles of TFP

2.1.3 超聲功率的影響

固定m(款冬花多糖)∶m(Fe3O4納米粒子)為1∶1.0、超聲時間為30 min,考察超聲功率對款冬花多糖磁性納米粒粒徑和PDI的影響,結果見圖3。

圖3 超聲功率對款冬花多糖磁性納米粒粒徑和PDI的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on particle size and PDI of magnetic nanoparticles of TFP

由圖3可知,隨著超聲功率的增大,款冬花多糖磁性納米粒的粒徑和PDI均逐漸減小,當超聲功率為400 W時,粒徑和PDI均最小;進一步增大超聲功率,粒徑和PDI均變化不大。因此,超聲功率以400 W為宜。

2.2 響應面實驗結果

2.2.1 響應面實驗設計及結果

響應面實驗的因素與水平見表1,設計及結果見表2。

表1 響應面實驗的因素與水平

表2 響應面實驗設計及結果

2.2.2 回歸模型的建立及方差分析

通過Design-Expert v 12軟件對表2數據進行擬合,得到款冬花多糖磁性納米粒粒徑(Y1)的回歸模型為:Y1=672.50+10.68A+3.06B+8.49C-5.58AB+12.98AC-48.30BC+66.22A2+39.20B2+21.20C2;款冬花多糖磁性納米粒PDI(Y2)的回歸模型為:Y2=0.5658-0.0390A+0.0136B+0.0189C+0.0262AB+0.0283AC-0.0510BC+0.0478A2+0.0356B2+0.0411C2。

回歸模型的方差分析分別見表3、表4。

表4 PDI方差分析

2.2.3 響應面分析

各因素交互作用對款冬花多糖磁性納米粒粒徑和PDI影響的響應面圖分別見圖4、圖5。

圖4 各因素交互作用對款冬花多糖磁性納米粒粒徑影響的響應面圖Fig.4 Response surface plots for effects of interaction between various factors on particle size of magnetic nanoparticles of TFP

圖5 各因素交互作用對款冬花多糖磁性納米粒PDI影響的響應面圖Fig.5 Response surface plots for effect of interaction between various factors on PDI of magnetic nanoparticles of TFP

響應曲面的傾斜度和坡度可直觀地反映兩因素交互作用影響的顯著性,傾斜度越低、坡度越平緩,則兩因素交互作用影響越不顯著;反之,則兩因素交互作用影響顯著。由圖4、圖5可知,曲線變化最大的是m(款冬花多糖)∶m(Fe3O4納米粒子),其次是超聲功率、超聲時間。

2.2.4 最佳工藝的確定

由Design-Expert v 12軟件預測款冬花多糖磁性納米粒的最佳制備工藝如下:m(款冬花多糖)∶m(Fe3O4納米粒子)為1∶1.018、超聲時間為24.587 min、超聲功率為360.892 W,粒徑預測值為668.423 nm,PDI預測值為0.555。綜合考慮實際操作,將最佳制備工藝調整為:m(款冬花多糖)∶m(Fe3O4納米粒子)為1∶1.0、超聲時間為30 min、超聲功率為400 W,在此條件下重復操作3次,得到款冬花多糖磁性納米粒粒徑為678.6 nm、PDI為0.554,測得款冬花多糖磁性納米粒中多糖含量為16.31%、鐵含量為31.31%。說明可以用該模型來分析和預測款冬花多糖磁性納米粒的制備工藝。

2.3 理化性質分析

2.3.1 紅外光譜分析(圖6)

圖6 款冬花多糖、Fe3O4納米粒子、款冬花多糖磁性納米粒的紅外光譜Fig.6 FTIR spectra of TFP,Fe3O4 nanoparticles,and magnetic nanoparticles of TFP

由圖6可知,款冬花多糖的紅外光譜中,599.97 cm-1處為Fe3O4的特征吸收峰。款冬花多糖磁性納米粒的紅外光譜中,3 427.74 cm-1處為羥基的O-H吸收峰;1 631.60 cm-1處為游離羧酸或羧酸鹽的C=O特征吸收峰;1 431.80 cm-1處為C-H吸收峰;1 125.97 cm-1處為C-O吸收峰;而577.08 cm-1處為Fe3O4的特征吸收峰。對比可知,加入款冬花多糖后,Fe3O4的特征吸收峰出現細微變化,但不影響整體吸收峰的變化。說明Fe3O4納米粒子在款冬花多糖磁性納米粒中以原來的結構存在,款冬花多糖只是作為載體包裹在Fe3O4納米粒子外層,起分散作用,并不影響多糖的結構。

2.3.2 粒徑分布(圖7)

圖7 款冬花多糖磁性納米粒的粒徑分布Fig.7 Particle size distribution of magnetic nanoparticles of TFP

由圖7可知,款冬花多糖磁性納米粒的粒徑分布均勻,平均粒徑為678.6 nm,PDI為0.554,表明款冬花多糖磁性納米粒分散性好,無明顯團聚現象發生。

3 結論

將款冬花多糖與Fe3O4納米粒子超聲反應制備了款冬花多糖磁性納米粒,以款冬花多糖磁性納米粒粒徑和PDI為考察指標,采用單因素實驗和Box-Behnken響應面法優化了款冬花多糖磁性納米粒的制備工藝。確定最佳制備工藝條件如下:m(款冬花多糖)∶m(Fe3O4納米粒子)為1∶1.0、超聲時間為30 min、超聲功率為400 W,在此條件下,款冬花多糖磁性納米粒的粒徑為678.6 nm、PDI為0.554,款冬花多糖磁性納米粒中多糖含量為16.31%、鐵含量為31.31%。納米劑型有望使款冬花多糖在發揮藥理活性治療肺癌時具有靶向性,在治療疾病的過程中能發揮最大功效,為開發款冬花多糖磁性納米粒相關抗腫瘤藥物提供了一定的依據。