HPLC法測定新疆沙棗花中椴樹苷與紫云英苷的含量

郭敬宇,巴依爾太,熊遠(yuǎn)果,萬超超,孫 蕓*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830011;2.新疆醫(yī)科大學(xué)圖書館,新疆 烏魯木齊 830011;3.武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部,湖北 武漢 430060)

沙棗(ElaeagnusangustifoliaL.)為胡頹子科胡頹子屬植物,是西北地區(qū)防風(fēng)固沙天然屏障之一。沙棗花氣味芳香濃郁,有“飄香沙漠的桂花”之稱[1]。《維吾爾藥志》中記載,沙棗花名為吉格德且其克,具有芳香補(bǔ)腦、平喘寬胸、防病除疫等功效,常用于治療哮喘、胸痛、關(guān)節(jié)炎等癥[2]。《沙漠地區(qū)藥用植物》中記載,沙棗花味甘、澀,性溫,可止咳平喘[3]。

沙棗花中的揮發(fā)性香氣成分主要為酯類、醛類、醇類等[4-8],具有抗氧化、抗炎等作用[9-11]。椴樹苷和紫云英苷是沙棗花中含量較多的黃酮類成分,目前關(guān)于其抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等藥理作用的研究較多[12-17],而關(guān)于其單成分定量方面的研究較少。鑒于此,作者采用HPLC法同時(shí)測定新疆不同產(chǎn)地沙棗花中椴樹苷、紫云英苷的含量,分析產(chǎn)地與各成分含量的相關(guān)性,擬為新疆沙棗花的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

沙棗花,采集于新疆喀什地區(qū)伽師縣米夏鄉(xiāng)(SZH-1,2022-04-28)、新疆五家渠市(SZH-2,2022-05-15)、新疆塔城地區(qū)額敏縣169團(tuán)(SZH-3,2022-05-25)、新疆克拉瑪依市東湖公園(SZH-4,2022-05-22)、新疆第七師130團(tuán)(SZH-5,2022-05-21)、新疆哈密市陶家宮鎮(zhèn)(SZH-6,2022-05-11)、新疆哈密市伊州區(qū)(SZH-7,2022-05-21)、新疆奎屯市東暉苑社區(qū)(SZH-8,2022-05-09)、新疆奎屯市高泉鎮(zhèn)124團(tuán)(SZH-9,2022-05-15)、新疆烏魯木齊市兒童公園(SZH-10,2022-05-14)、新疆烏魯木齊市鯉魚山公園(SZH-11,2022-05-22)、新疆烏魯木齊市南湖公園(SZH-12,2022-05-24)、新疆烏魯木齊市植物園(SZH-13,2022-05-25)、新疆烏魯木齊市西山民族鄉(xiāng)(SZH-14,2022-05-20)、新疆烏魯木齊市西山104團(tuán)(SZH-15,2022-05-20)、新疆烏魯木齊市小綠谷公園(SZH-16,2022-05-25)等地,經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)醫(yī)院田紅林主任藥師鑒定為胡頹子科胡頹子屬植物沙棗(ElaeagnusangustifoliaL.)的花。

1.2 試劑與儀器

椴樹苷對照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%,批號wkq21062504),四川維克奇生物科技有限公司;紫云英苷對照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%,批號7346),上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司;乙腈、磷酸、乙酸,色譜純;其余試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

Agilent 1200型高效液相色譜儀,安捷倫科技有限公司;AB135-S型分析天平,梅特勒-托利多儀器有限公司;KQ5200DE型超聲波清洗器,昆山超聲儀器有限公司;艾柯超純水儀,成都艾柯環(huán)保設(shè)備有限公司。

1.3 溶液的制備

對照溶液的制備:精密稱取椴樹苷對照品、紫云英苷對照品適量,加甲醇溶解,制成質(zhì)量濃度分別為0.406 0 mg·mL-1、0.105 0 mg·mL-1的對照溶液,過0.22 μm微孔濾膜,備用。

供試溶液的制備:稱取沙棗花粉末約1 g,按料液比1∶20(g∶mL)加入70%乙醇,置于具塞錐形瓶中,精密稱重;超聲(200 W,40 kHz)處理30 min,再次稱重,補(bǔ)足重量,取上清液,過0.22 μm微孔濾膜,即得供試溶液,備用。

1.4 色譜條件

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫30 ℃。流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脫程序:0～15 min,10%～23%A;15～20 min,23%～35%A;20～25 min,35%～40%A;25～30 min,40%A。流速1.0 mL·min-1;檢測波長360 nm;進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件分析

取混合對照溶液、供試溶液,按1.4色譜條件進(jìn)樣分析,結(jié)果見圖1。

圖1 混合對照溶液(a)及供試溶液(b)的HPLC圖譜Fig.1 HPLC spectra of mixed control solution(a) and test solution(b)

由圖1可知,供試溶液中椴樹苷和紫云英苷有明顯的吸收峰,且分離度較好,均大于1.5,表明該色譜條件適用于沙棗花中椴樹苷、紫云英苷的含量測定。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察

將椴樹苷對照溶液、紫云英苷對照溶液等比例稀釋成不同濃度,按1.4色譜條件進(jìn)樣分析。以對照品濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,擬合得線性回歸方程:椴樹苷:y=4.4216x+1.8657,R2=0.9999;紫云英苷:y=6.4081x+0.9861,R2=0.9998。椴樹苷、紫云英苷濃度分別在12.687 5～406.00 μg·mL-1、3.281 3～105.00 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.2 精密度考察

取混合對照溶液,按1.4色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算得到椴樹苷、紫云英苷峰面積的RSD值分別為0.42%、0.38%,表明儀器精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性考察

取沙棗花粉末6份,按1.3方法制備供試溶液,按1.4色譜條件進(jìn)樣分析,計(jì)算得到椴樹苷、紫云英苷峰面積的RSD值分別為1.28%、1.35%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性考察

取沙棗花供試溶液,按1.4色譜條件分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣分析,計(jì)算得到椴樹苷、紫云英苷峰面積的RSD值分別為0.32%、1.00%,表明供試溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 加標(biāo)回收率考察

精密吸取已知椴樹苷、紫云英苷含量的供試溶液9份各1 mL,按低、中、高水平加入已知含量的對照溶液,按1.4色譜條件進(jìn)樣分析,結(jié)果見表1。

表1 加標(biāo)回收率結(jié)果(n=9)

2.3 實(shí)際樣品測定

取16批沙棗花藥材,按1.3方法制備供試溶液,按1.4色譜條件進(jìn)樣分析,計(jì)算椴樹苷、紫云英苷的含量,結(jié)果見表2。

表2 椴樹苷、紫云英苷含量測定結(jié)果(n=3)/(mg·g-1)

2.4 聚類分析

將16批沙棗花樣品中椴樹苷、紫云英苷含量測定結(jié)果導(dǎo)入IBM SPSS Statistics 21軟件中,采用系統(tǒng)聚類、組間聯(lián)接、平方歐氏距離等方法進(jìn)行聚類分析,結(jié)果見圖2。

圖2 16批樣品聚類分析樹狀圖Fig.2 Cluster analysis dendrogram of 16 batches of samples

由圖2可知,當(dāng)間距為10時(shí),16批樣品分為3類:SZH-8、SZH-15為一類,SZH-16為一類,SZH-1～SZH-7、SZH-9～SZH-14為一類。

2.5 討論

采用DAD檢測器在200～800 nm范圍內(nèi)分別對椴樹苷、紫云英苷進(jìn)行全光譜掃描。結(jié)果顯示,椴樹苷在320 nm處有最大吸收,紫云英苷在360 nm處有最大吸收。通過比較2種檢測波長下,供試溶液中椴樹苷、紫云英苷的響應(yīng)值,最終選定檢測波長為360 nm。

參照相關(guān)文獻(xiàn),選取乙腈-磷酸水溶液、乙腈-乙酸水溶液等流動(dòng)相體系進(jìn)行比較,最終選定乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,發(fā)現(xiàn)HPLC圖譜基線平穩(wěn),目標(biāo)組分與干擾組分能夠良好分離。

通常植物的有效成分或活性成分主要是次生代謝產(chǎn)物,次生代謝產(chǎn)物的積累受生態(tài)、環(huán)境等因素的影響[18]。以16批沙棗花為樣本的聚類分析結(jié)果表明,16批沙棗花中椴樹苷和紫云英苷含量差異較大,椴樹苷含量均高于紫云英苷含量,其中新疆奎屯市東暉苑社區(qū)、新疆烏魯木齊市植物園、新疆烏魯木齊市西山104團(tuán)、新疆烏魯木齊市小綠谷公園等4批沙棗花的椴樹苷、紫云英苷含量均較高,可能是土壤環(huán)境、采摘時(shí)間不同導(dǎo)致。

3 結(jié)論

建立了同時(shí)測定新疆不同產(chǎn)地沙棗花中椴樹苷、紫云英苷含量的HPLC法,測得16批沙棗花樣品中椴樹苷、紫云英苷含量分別為2.395 7～4.714 0 mg·g-1、0.070 7～0.166 4 mg·g-1。16批沙棗花聚類分析結(jié)果表明,椴樹苷、紫云英苷的含量與產(chǎn)地關(guān)系不大,沒有地域接近、含量接近的現(xiàn)象。本研究為沙棗樹的合理種植、沙棗花產(chǎn)品的開發(fā)及質(zhì)量控制提供了一定的依據(jù)。