那他霉素光降解雜質的制備與結構鑒定

董 月,于 蘭#,李曉露,曹鵬然,林 旸,趙建強

(1.華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司 微生物藥物國家工程研究中心河北省工業微生物代謝技術創新中心,河北 石家莊 052165;2.華北制藥華勝有限公司,河北 石家莊 052160)

那他霉素(Natamycin),又稱匹馬霉素(Pimamycin),是一種首次從鏈霉菌中提取得到的四烯類抗生素。那他霉素最早被用作食品添加劑,用于抑制食品中酵母、霉菌的生長。體外活性研究顯示,那他霉素具有抗多種絲狀真菌和酵母的活性,與利福平或慶大霉素聯用對鐮刀菌具有協同抑制作用[1-4]。那他霉素的抗真菌活性與劑量具有一定相關性,殺菌機制為:其與真菌細胞膜上的固醇相結合轉化為多烯固醇復合物,通過改變細胞膜內外滲透壓使細胞內容物外溢,造成真菌細胞死亡[5]。1978年,那他霉素眼用制劑在美國批準上市,用于治療真菌性角膜炎,療效顯著[6-8]。目前,那他霉素已被廣泛應用于抗真菌治療、食品綠色防腐及農業真菌性病害治理等領域,具有巨大的社會價值。

那他霉素經微生物發酵、提煉和精制制得,為白色或淡黃色結晶粉末。那他霉素原料藥在存放過程中雜質含量不斷增加,且該雜質對光敏感。隨著藥品質量標準的不斷提高,藥品雜質特別是潛在雜質控制越來越受到重視。鑒于此,作者將那他霉素精品進行光降解,得到那他霉素光降解雜質粗品,采用制備液相色譜法對那他霉素光降解雜質粗品進行分離純化,并通過MS和NMR等分析手段對其結構進行鑒定,為那他霉素的質量控制及安全儲運提供技術參考。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

那他霉素精品(批號YFNT220301,純度99.1%),華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司;乙腈、甲醇、氘代二甲基亞砜(DMSO-d6),色譜純,美國Merck公司;乙腈、甲醇,制備級,安徽時聯特種溶劑股份有限公司;其它試劑均為分析純。

分析液相色譜系統,Agilent公司;制備液相色譜系統,北京澳諾科技有限公司;光照試驗儀,Star iTech公司;TDL-40B型臺式離心機,上海安亭科學儀器廠;旋轉蒸發器,Heidolph公司;分析天平,Mettler-Toledo公司;質譜儀(Acquity UPLC系統,PDA檢測器),Waters公司;AVANCE Ⅲ 500型核磁共振波譜儀,Bruker公司。

1.2 方法

1.2.1 那他霉素精品的光降解

取10 g那他霉素精品于表面皿中攤成薄層,置于光照試驗儀中進行光降解實驗,調整光照強度為5 000 Lx,每隔一定時間取樣檢測,當目標雜質比例達到一定要求后,停止光照,得到那他霉素光降解雜質粗品。

1.2.2 那他霉素光降解雜質粗品的分離純化

將那他霉素光降解雜質粗品用甲醇溶解,參照《中華人民共和國藥典2020年版 二部》[9]中那他霉素有關物質檢測條件進行HPLC在線分析,收集目標雜質純度大于95%的洗脫液,濃縮至干,得到那他霉素光降解雜質純品。

1.2.3 檢測條件

制備色譜條件:Kromasil 100-10-C18制備色譜柱(21.2 mm×250 mm),洗脫劑為乙腈-2%乙酸銨緩沖液(30∶70,體積比,下同),檢測波長為303 nm。

質譜條件:樣品用甲醇溶解,電噴霧電離源(ESI),正離子檢測。

核磁共振波譜條件:樣品用DMSO-d6溶解。

2 結果與討論

2.1 光照時間對那他霉素光降解的影響

按1.2.1方法在光照強度5 000 Lx下進行光降解實驗,分別在5 d、10 d、15 d、20 d、25 d、30 d取樣檢測,那他霉素目標雜質比例分別為0、0.11%、0.24%、1.13%、1.80%、2.37%。結果表明,在強光照射下,那他霉素易降解生成目標雜質,且隨著光照時間的延長目標雜質比例逐漸增大,同時有其它雜質生成。

2.2 純化條件優化

洗脫劑對那他霉素光降解雜質粗品純化效果的影響見表1。

表1 洗脫劑對那他霉素光降解雜質粗品純化效果的影響

由表1可知,以乙腈-1%醋酸水溶液(40∶60)為洗脫劑時,目標雜質與那他霉素不能有效分離;以乙腈-1%醋酸水溶液(30∶70)為洗脫劑時,分離效果略好,但出峰時間較長,且峰型較寬、拖尾嚴重;以乙腈-1%乙酸銨緩沖液(30∶70)為洗脫劑時,峰型較好,但不能實現良好分離;以乙腈-2%乙酸銨緩沖液(30∶70)為洗脫劑時,分離效果明顯改善,目標雜質HPLC純度達到95%以上。因此,選擇乙腈-2%乙酸銨緩沖液(30∶70)作為洗脫劑進行分離純化,得到那他霉素光降解雜質純品16 mg。

那他霉素光降解雜質粗品和純品的HPLC圖譜見圖1。

2.3 雜質結構鑒定

2.3.1 MS分析(圖2)

圖2 那他霉素光降解雜質的MS圖譜Fig.2 MS spectrum of photodegradation impurity of Natamycin

2.3.2 NMR分析

那他霉素光降解雜質的13CNMR和1HNMR數據見表2。

表2 那他霉素光降解雜質的13CNMR和1HNMR數據

2.3.3 結構解析

由MS(ESI+)圖譜可知,該光降解雜質的相對分子質量為665,與那他霉素的相對分子質量相同。參照文獻[5]對NMR數據進行分析,發現該光降解雜質與那他霉素的C、H個數相同,因此,確定該光降解雜質的分子式與那他霉素相同。比對該光降解雜質與那他霉素的NMR數據,可以看出二者數據基本一致,其中C12 (ΔδC2.8)、C15(ΔδC2.6)、C27(ΔδC1.6)等的化學位移差別較大,推測是由C15和C12構型的改變引起;在NOESY圖譜中可觀察到H12/H14和H12/H10的NOE效應,表明H12為β朝向;NOESY圖譜中H15與H12無NOE相關,表明H15為α朝向,即C15處構型未發生改變。

綜上,推測該光降解雜質為那他霉素的C12位差向異構體,其結構式見圖3。

圖3 那他霉素光降解雜質的結構式Fig.3 Structure formula of photodegradation impurity of Natamycin

3 結論

將那他霉素精品在光照強度5 000 Lx下進行光降解,得到那他霉素光降解雜質粗品,采用制備液相色譜法對那他霉素光降解雜質粗品進行分離純化,并通過MS和NMR 等分析手段對其結構進行鑒定,確定該光降解雜質為那他霉素的C12位差向異構體。該研究開發了一種微量潛在雜質的制備方法,對于開展藥品質量控制和安全性評價具有重要意義。