水虻HiACC和HiFAS的克隆與表達模式分析

朱麗景,嚴婷婷,董夢瑤,周煜琛,蔡珉敏,黃 鳳,張吉斌,喻子牛,鄭龍玉

(華中農業大學,湖北 武漢 430070)

亮斑扁角水虻(HermetiaillucensL.,black soldier fly),屬于雙翅目(Diptera)、水虻科(Stratiomyidae)、扁角水虻屬昆蟲,在全球亞熱帶及熱帶地區均有分布[1-2]。水虻是一種重要的資源昆蟲,蛋白和脂肪含量高是其重要特征之一。其幼蟲具有生長周期短、易獲得、油脂含量高等特點,利用水虻幼蟲生產昆蟲油脂及其下游產物生物柴油[3],為構筑新型的綠色、循環、可持續產業體系提供了新思路,具有重要的現實意義[4]。昆蟲機體需精細表達調控來合成重要供能物質油脂,進而輔助完成生長、發育、繁殖、信息交流等生命過程[5]。揭示水虻油脂合成代謝通路關鍵基因表達模式及分子調控機理有助于優化水虻的生產性能,為水虻油脂大量定向積累、提升畜禽糞便等有機廢棄物的資源化利用效率、實現廢棄物向綠色能源的高效轉換提供理論支撐,進而助力我國未來能源保障[6]。

昆蟲脂肪體是維持體內能量平衡的動力來源,也是在變態過程中長時間不進食時脂肪的必要儲藏庫[7-8]。大部分營養物質被昆蟲吸收后,以甘油三酯形式儲存在體內[9]。而用于合成甘油三酯的脂肪酸是膜組分和信號分子的重要前體,其合成通路在維持昆蟲體內平衡起重要作用[10-11]。脂肪酸合成是一個復雜的多步反應過程,主要由乙酰輔酶 A 羧化酶( acetyl-coenzyme A carboxylase,ACC) 、脂肪酸合成酶( fatty acid synthase,FAS) 、去飽和酶( fatty acid desaturase,FAD) 等參與完成[12-13]。在脂肪酸從頭合成通路中,關鍵限速酶主要是ACC、FAS[14]。作者所在課題組前期獲得了完整的水虻基因組[15],并通過轉錄組數據與基因組數據結合分析確定了參與水虻油脂合成的重要酶,包括乙酰輔酶 A 羧化酶 ACC(HiOGS00269)、脂肪酸合成酶 FAS(HiOGS16234,HiOGS10629,HiOGS07375)、甘油-3-磷酸-酰基轉移酶 GPAT3_4(HiOGS13303,HiOGS14391)和二酰基甘油酰基轉移酶 DGAT1(HiOGS02525)[16]。研究發現,RNA干擾黑腹果蠅脂肪體中的ACC,會導致儲存的甘油三酯急劇減少[17];敲除埃及伊蚊體內ACC和脂肪酸合成酶1(FAS1)基因后,脂肪體脂質生物合成和中腸消化速率減慢[12];猿葉蟲FAS2酶參與滯育期的脂質積累,積累的脂質在滯育期有調節抗脅迫基因表達和含水量的作用[18];沉默斜紋夜蛾3齡幼蟲的SlFAS1基因可以抑制脂肪酸和甘油三酯的合成,進而影響其發育[19]。上述研究表明,ACC和FAS在昆蟲中的功能主要包括影響脂質積累、表皮脂質合成、脅迫耐受力等。因此,研究ACC和FAS的基因對于理解水虻脂肪酸合成途徑以及提高水虻油脂大量定向積累具有重要意義[20]。

目前,關于水虻脂質代謝的研究主要集中在飼料基質、營養添加劑等營養因子對水虻粗脂肪、粗蛋白及脂肪酸組成的影響,缺乏系統性的基因功能與表達調控研究[21]。鑒于此,作者通過實時熒光定量 PCR(RT-qPCR)克隆獲得ACC和FAS的基因開放閱讀框(open reading frame,ORF)全長,對其進行序列分析和系統進化樹構建,并利用RT-qPCR 檢測分析其在水虻不同發育階段、組織、營養條件下的表達模式,為深入研究水虻ACC和FAS基因在水虻油脂合成中的表達調控機制,實現水虻油脂的高效積累提供理論支撐。

1 實驗

1.1 材料

水虻為武漢品系,由華中農業大學國家微生物農藥工程研究中心提供。飼養條件:由麩皮和小麥次粉按質量比1∶1配制成人工飼料,濕度保持在70%～80%,飼養溫度約(28±2) ℃,光周期為14 L∶10 D。

1.2 樣品前處理

分別收集水虻卵、1齡、2齡、3齡、4齡、5齡、預蛹、蛹、成蟲等9個不同發育階段的樣品和4齡、5齡幼蟲的頭部、表皮、前中腸、后腸、脂肪體等 5個不同組織樣品,樣品均按5頭為1個生物學重復,共設3個生物學重復。

挑選發育基本一致、健康的5齡幼蟲100頭于不含食物的塑料白桶中(塑料白桶底部均勻鋪滿濕潤的棉花)飼養,作為饑餓組;挑選發育基本一致、健康的5齡幼蟲100頭于含高脂人工飼料(10%大豆油+基礎飼料)的塑料白桶中飼養,作為高脂飼喂組;挑選發育基本一致、健康的5齡幼蟲100頭于含基礎飼料的塑料白桶中正常飼養,作為基礎飼喂對照組。4 d后,分別收集處理組和對照組水虻幼蟲,置于含有約200 μL Trizol 的 1.5 mL 離心管中,用液氮迅速冷凍,置于-80 ℃冰箱中保存,各組做3個重復。

1.3 總RNA提取和cDNA合成

使用Trizol Reagent試劑提取各樣品中的總RNA,利用Nano Drop One超微量分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA濃度和質量。使用HiScipt?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA第1鏈,用于后續基因克隆和RT-qPCR實驗。

1.4 引物設計

從實驗室水虻基因組及轉錄組數據庫中篩選獲得ACC基因和FAS基因的cDNA全長序列。利用NCBI Primer Blast軟件設計基因克隆引物及RT-qPCR引物。在RT-qPCR實驗中,選擇已公布的水虻Tublin、PR49基因作為內參基因,引物均由武漢擎科生物科技有限公司合成。引物序列如下:ACC-F:5′-CGTGCTGTTCGTTTCGTTGT-3′;ACC-R:5′-GGCAAC- GTTGGAATATCGGC-3′;FAS1-F:5′-GGTGTTG-AAATGCGTGGCT-3′;FAS1-R:5′-GACCTTCTTCCTGTTGCGGA-3′;FAS2-F:5′-GGTGTTGAAATGC-GTGGCTT-3′;FAS2-R:5′-ACCTTCTTCCTGTTGCGGA-3′;FAS3-F:5′-CAAGGACCGTAAGACCCC-AC-3′;FAS3-R:5′-AAATTGGCCGCTTTGTGTCC-3′;qPCR-ACC-F:5′-ACAACCGAAGATTACAGCCG-3′;qPCR-ACC-R:5′-GACAACATAGGAACCAATACCAA-3′;qPCR-FAS1-F:5′-TTGTGCCTATGCCGATG-GTT-3′;qPCR-FAS1-R:5′-TTGTGGCAAGCAGCA-ATCAC-3′;qPCR-FAS2-F:5′-ATCAATCGGGCGA-AACCCTT-3′;qPCR-FAS2-R:5′-ACACTACGGGG-GTTTGTGAC-3′;qPCR-FAS3-F:5′-AAGCGTGGTA-CAATGTCGGT-3′;qPCR-FAS3-R:5′-ACGTACCGAA-GGAGTAGCCT-3′;qPCR-Tublin-F:5′-GCTCTCTA-CGACATCTGCTTTA-3′;qPCR-Tublin-R:5′-CAGGT-GGTAACTCCAGACATT-3′;qPCR-RP49-F:5′-CCCA-CTGGCTTCAAGAAGTT-3′;qPCR-RP49-R:5′-CG-AAACTCCATGTGCGATCT-3′。

1.5 基因克隆

根據引物序列,利用 RT-qPCR技術擴增HiACC、HiFAS1、HiFAS2、HiFAS3 的ORF 全長序列。PCR 反應體系(20 μL):cDNA 模板 2 μL,10 μmol·L-1正、反向引物各 1 μL,ddH2O 6 μL,2×Taq Mix 10 μL。PCR 反應條件:94 ℃預變性10 min;94 ℃變性30 s,52～62 ℃(根據引物的退火溫度調整)退火30 s,72 ℃延伸90 s,30 個循環;72 ℃徹底延伸8 min。利用瓊脂糖凝膠電泳對 PCR 產物進行檢測,目的片段通過膠回收試劑盒回收,回收產物連接至pMD18-T克隆載體并轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中,將菌液轉移至氨芐青霉素抗性的LB固體培養基平板上,37 ℃過夜培養,挑取白色單克隆菌斑進行菌液 PCR鑒定后,將陽性菌液送武漢擎科生物科技有限公司進行測序。

1.6 生物信息學分析

用如下在線工具或軟件對目的基因序列進行生物信息學分析:亞細胞定位預測:Euk-m PLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/);氨基酸序列預測:ExPASy(http://web.expasy.org/translate/);可磷酸化位點預測:Net Phos3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/Net Phos/);保守結構域分析:SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set/);跨膜結構域預測:TMHMM Services 2.0(http://www.ebs.dtu.dk/services/TMHMM/);理化性質分析:Protparam(http://web.expasyorg/cgi-bin/protparam);系統進化樹構建:MEGA7.0;信號肽預測:SignalP4.0 Server(http://www.ebs.dtu.dk/services/SignalP/)。

1.7 表達模式檢測

使用 ChamQ Universal SYBR?qPCR Master Mix進行RT-qPCR,檢測HiACC、HiFAS1、HiFAS2、HiFAS3等4個基因在水虻9個發育階段、4齡和5齡幼蟲的5個不同組織、3種營養條件下處理4 d后水虻幼蟲的表達模式。反應體系(10 μL):2 × ChamQ Universal SYBR Master Mix 5 μL,cDNA 模板 1 μL,正、反向引物各0.5 μL,ddH2O 3 μL。PCR反應條件:95 ℃預變性10 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火+延伸30 s,40 個循環;溶解曲線采集程序:95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min。每個樣品做3 個生物學重復和 4個技術性重復。采用2-ΔΔCT法分析基因相對表達量。

1.8 數據分析

采用 SPSS 19.0 軟件中的 ANOVA 法對實驗數據進行單因素方差分析,采用GraphPad Prism8軟件進行分析和作圖,數據表示為平均值±標準偏差(sd)。

2 結果與討論

2.1 水虻脂肪酸合成關鍵基因的克隆與序列分析

利用RT-qPCR克隆獲得HiACC、HiFAS1、HiFAS2、HiFAS3的ORF全長序列,基于果蠅的ACC和FAS基因序列,在水虻基因組數據庫中通過同源搜索鑒定到1個ACC和3個FAS基因,分別命名為HiACC、HiFAS1、HiFAS2、HiFAS3。利用生物信息學軟件對目的序列進行分析,目的基因的序列特征和理化性質如表1所示,預測的蛋白功能結構域示意圖如圖1所示。

圖1 水虻脂肪酸合成關鍵基因蛋白的預測功能結構域示意圖Fig.1 Schematic diagram of predicted functional domains of key gene proteins for fatty acid synthesis in black soldier fly

表1 水虻脂肪酸合成關鍵基因的序列特征和理化性質

由表1可知,HiACC、HiFAS1、HiFAS2、HiFAS3等4個基因的ORF全長分別為7 071 bp、7 068 bp、6 810 bp、7 164 bp,編碼氨基酸長度分別為2 356 aa、2 353 aa、2 267 aa、2 387 aa,等電點分別為5.75、6.25、6.45、6.40,4個蛋白亞細胞均定位于細胞質,不含信號肽蛋白,沒有跨膜結構,含有多個絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸可磷酸化位點。

由圖1可知,HiACC蛋白結構域包括乙酰輔酶A羧化酶核心域(ACC-central)、羧基轉移酶結構域(Carboxyl-trans)以及保守的生物素載體蛋白(Biotin-carb-N,BcN;Biotin-carb-C,BcC;Biotin-lipoyl,Bl;CP-Sase-L-D2,CLD2)結構域。HiFAS1、HiFAS2、HiFAS3蛋白均含有8個相同的功能結構域:7個FAS蛋白保守催化功能結構域β-羥酰脫水酶(PS-DH)、烯酰還原酶(PKS-ER)、β-酮乙基還原酶(PKS-KR)、酰基載體蛋白(PP-binding,Pb)、丙二酰基轉移酶(Acyl-transf-1,At1)、硫酯酶(Thioesterase,Th)、酮脂酰合成酶(Ks)和1個Kasynt-C-assoc(KCa)功能結構域。表明HiACC、HiFAS1、HiFAS2、HiFAS3均含有典型的催化功能結構域。

2.2 水虻脂肪酸合成關鍵基因的系統發育樹

將水虻脂肪酸合成關鍵基因的蛋白氨基酸序列上傳至NCBI數據庫中進行Blast比對,根據氨基酸序列的同源性比對結果,下載同源性較高物種的ACC、FAS蛋白氨基酸序列。選取2種哺乳動物和5個目中的12種昆蟲的ACC氨基酸序列與水虻的HiACC氨基酸序列進行ClustarW多序列比對,包括智人、家鼠、家蠅、黑腹果蠅、銅綠蠅、廄螫蠅、致倦庫蚊、埃及伊蚊、豌豆蚜、家蠶、小菜蛾、煙草天蛾、赤擬谷盜、意大利蜜蜂、德國小蠊。選取1種哺乳動物和7個目中的11種昆蟲的FAS1、FAS2、FAS3氨基酸序列與水虻的HiFAS1、HiFAS2、HiFAS3氨基酸序列進行ClustarW多序列比對,包括家鼠、家蠅、黑腹果蠅、豌豆蚜、家蠶、煙草天蛾、赤擬谷盜、意大利蜜蜂、繭蜂、蠅蛹金小蜂、德國小蠊、飛蝗。使用MEGA7.0軟件的N-J鄰接法構建系統發育樹,結果如圖2所示。

注:哺乳動物:智人(Homo sapiens,Hs)、家鼠(Mus musculus,Mm);雙翅目昆蟲:家蠅(Musca domestica,Md)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster,Dm)、銅綠蠅(Lucilia cuprina,Lc)、廄螫蠅(Stomoxys calcitrans,Sc)、致倦庫蚊(Culex quinquefasciatus,Cq)、埃及伊蚊(Aedes aegypti,Aa);半翅目昆蟲:豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum,Ap);鱗翅目昆蟲:家蠶(Bombyx mori,Bm)、小菜蛾(Plutella xylostella,Px)、煙草天蛾(Manduca sexta,Ms);鞘翅目昆蟲:赤擬谷盜(Tribolium castaneum,Tc);膜翅目昆蟲:意大利蜜蜂(Apis mellifera,Am)、繭蜂(Chelonus insularis,Ci)、蠅蛹金小蜂(Nasonia vitripennis,Nv);蜚蠊目昆蟲:德國小蠊(Blattella germanica,Bg);直翅目昆蟲:飛蝗(Locusta migratoria,Lm)。

由圖2a可知,水虻HiACC氨基酸序列與黑腹果蠅DmACC的親緣關系較近。由圖2b可知,水虻HiFAS1、HiFAS2、HiFAS3分別與黑腹果蠅DmFAS1、DmFAS2、DmFAS3的親緣關系較近。HiFAS3蛋白和HiFAS1、HiFAS2蛋白聚在不同的分支上,推測HiFAS3與HiFAS1、HiFAS2的功能有較大差異,HiFAS1與HiFAS2的生物功能相似。系統發育樹分析顯示,水虻的HiACC、HiFAS1、HiFAS2、HiFAS3氨基酸序列與黑腹果蠅的DmACC、DmFAS1、DmFAS2、DmFAS3氨基酸序列親緣關系較近,表明這4個基因蛋白質在雙翅目昆蟲中高度保守。

2.3 水虻脂肪酸合成關鍵基因在不同發育階段的表達模式

選取水虻卵、1～5齡幼蟲、預蛹、蛹、成蟲等9個發育階段的樣品,利用RT-qPCR檢測水虻脂肪酸合成關鍵基因在不同發育階段的相對表達量,結果如圖3所示。

注:各柱上不同小寫字母代表顯著性差異(P<0.05,ANOVA,LSD),誤差棒代表3次校準差的平均值,下圖同。

由圖3可知,基因HiACC、HiFAS1、HiFAS2、HiFAS3在水虻整個生長發育階段均有表達,在卵期、4～5齡幼蟲期表達量較高,在蛹期表達量較低。水虻卵期脂肪酸合成關鍵基因的高表達,說明這4個基因在卵發育積累營養物質期間發揮重要作用;在水虻幼蟲經歷蛻皮發育到下一個幼蟲齡期的過程中,脂肪酸合成關鍵基因的表達量也逐步升高,說明這4個基因在幼蟲的生長發育過程中具有重要的作用;在蛹期,水虻將預蛹期積累的大量營養物質分解代謝供能于變態發育進行下一步羽化,此時脂肪酸合成關鍵基因幾乎不表達,該現象與此階段的生命活動功能相對應。發育階段表達模式分析表明,HiACC、HiFAS1、HiFAS2、HiFAS3是影響水虻卵孵化、蛻皮變態發育、脂質積累過程中的重要基因。水虻脂肪酸的合成與發育階段有一定的相關性,在卵孵化和中齡幼蟲期脂代謝速率快,從而導致脂肪酸合成關鍵基因的高水平表達。

2.4 水虻脂肪酸合成關鍵基因在不同組織中的表達模式

解剖水虻4齡、5齡幼蟲的5個不同組織(頭、表皮、前中腸、后腸和脂肪體),利用RT-qPCR檢測水虻脂肪酸合成關鍵基因在4齡、5齡幼蟲不同組織中的相對表達量,結果如圖4所示。

圖4 水虻脂肪酸合成關鍵基因在4齡、5齡幼蟲不同組織中的相對表達量Fig.4 Relative expression levels of key genes for fatty acid synthesis in different tissues of 4th to 5th instar larvae of black soldier fly

由圖4可知,基因HiACC、HiFAS1、HiFAS2、HiFAS3在4齡、5齡幼蟲的不同組織中均有表達,其中在脂肪體、前中腸和表皮中的表達量較高,在頭和后腸中的表達量較低。表明上述4個基因在水虻的脂質儲存和脂質吸收過程中發揮重要作用。HiACC、HiFAS1、HiFAS2、HiFAS3在中齡(4齡、5齡)幼蟲的表皮中表達量較高,這可能與幼蟲的蛻皮發育過程相關,推測水虻脂肪酸合成關鍵基因與其表皮脂質的合成相關。

與水虻4齡幼蟲相比,5齡幼蟲4個基因在各個組織的表達模式有所不同。但從總體變化趨勢上看,HiFAS1、HiFAS2這2個基因在4齡、5齡幼蟲的脂肪體組織中均有最高的相對表達量;HiFAS3在4齡、5齡幼蟲的前中腸中均有最高的相對表達量;特別是,與4齡幼蟲相比,5齡幼蟲HiACC在各組織中的最高相對表達量由脂肪體轉變為前中腸。表明HiACC、HiFAS1、HiFAS2、HiFAS3可能密切參與水虻脂質積累或脂肪酸代謝活動,同時在不同組織間的表達量差異也與其功能多樣性相關。

2.5 水虻脂肪酸合成關鍵基因在不同營養條件下的表達模式

水虻5齡幼蟲分別經饑餓、基礎飼料添加大豆油喂食、基礎飼料喂食處理4 d后,通過RT-qPCR技術檢測水虻脂肪酸合成關鍵基因在不同營養條件下的相對表達量,結果如圖5所示。

圖5 水虻脂肪酸合成關鍵基因在不同營養條件下的相對表達量Fig.5 Relative expression levels of key genes for fatty acid synthesis in black soldier fly under different nutritional conditions

由圖5可知,基因HiACC、HiFAS1、HiFAS2、HiFAS3在不同營養條件下的表達水平順序為:基礎飼喂對照組>高脂飼喂組>饑餓組。與基礎飼喂對照組相比,饑餓組、高脂飼喂組的4個基因的相對表達量均顯著下調。推測在饑餓脅迫下,水虻體內儲存的三酰甘油用于氧化分解供能維持基礎生命活動,機體脂質分解代謝速率快于脂質合成速率,導致水虻脂肪酸合成關鍵基因表達量顯著低于基礎飼喂對照組;推測在高脂脅迫后,水虻通過脂質代謝各通路間的協調,減少飼料的進食,導致水虻幼蟲發育期的延長和個體大小的改變,從而使脂肪酸合成速率減慢,脂肪酸合成關鍵基因表達顯著下調。上述分析表明,水虻幼蟲在受到營養脅迫后,可能通過下調脂肪酸合成關鍵基因的表達,加強氧化分解體內儲存的甘油三酯來供能以應對不適生存條件的威脅。

3 結論

通過RT-qPCR技術克隆獲得了水虻脂肪酸合成關鍵基因HiACC、HiFAS1、HiFAS2、HiFAS3,4個基因編碼的蛋白質均具有保守的催化功能域;均在水虻卵期、4～5齡幼蟲期高度表達,高豐度表達于水虻4齡、5齡幼蟲的脂肪體和前中腸,在饑餓、高脂脅迫下表達量均顯著下調,表明ACC和 FAS與水虻油脂高效積累密切相關。為進一步研究ACC和 FAS在水虻脂質積累過程中的表達調控機制,實現水虻油脂高效積累提供了理論依據。