液相色譜-質(zhì)譜法測定火鍋湯料中的罌粟堿

◎ 林達(dá)峰，趙曉野，梁 瓊，王 儒

（海南省食品藥品檢驗(yàn)所海口分所，海南 海口 570311）

本研究建立了火鍋底料中非法添加罌粟殼的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定法，采用乙腈和無水醋酸鈉萃取罌粟殼中的生物堿分。其中，色譜柱SHISEIDO CAPCELL PAK CR1∶4（5 μm，2.0 mm×150 mm）色譜分離；流動相為20 mmol·L-1；乙酸銨∶乙腈（50∶50），0.5%甲酸為A相，乙腈為流動相B相。該方法的嗎啡、可待因方法檢出限為12 μg·kg-1；定量限為40.0 μg·kg-1；線性范圍為1～40 ng·mL-1；罌粟堿、蒂巴因和那可丁為3 μg·kg-1；定量限為8 μg·kg-1，線性范圍為0.05～2 ng·mL-1，加標(biāo)回收率64.2%～101.1%。結(jié)果表明，用該方法可快速、準(zhǔn)確測定火鍋底料罌粟堿中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁、蒂巴因5種生物堿的含量，適用于火鍋調(diào)味料食品中罌粟殼的檢測。

1 概況

罌粟殼含20余種生物堿類，堿性物質(zhì)會使人產(chǎn)生一種安逸和興奮的感覺，如果長時(shí)間使用，可能會出現(xiàn)身體、心理、精神等方面的問題。當(dāng)前，相關(guān)部門對于食品安全的重視日益提高，因此，快速準(zhǔn)確檢測食物中的生物堿類物質(zhì)，具有十分重要的意義。具體來說，光譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-質(zhì)譜法，是當(dāng)前對堿性物質(zhì)進(jìn)行檢測的重要手段[1]。

2 試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1 材料與試藥

①儀器。AB5500+液質(zhì)聯(lián)用色譜儀（Sciex）；X1R型離心分離機(jī)（德國 Eppendorf公司）；超純水產(chǎn)生器（美國密立浦公司）；CP225D儀器（德國SARRIUS公司）。②試驗(yàn)材料和試藥。在磷酸中，可待因（批號：171203-201005，含量：99.6%)；嗎啡（批號：171201-200822，含量：99.8%)；鹽酸中的罌粟堿（批號：171214-200404)；蒂巴因（Tibanine)；中國制藥工業(yè)研究所生產(chǎn)的那可丁（批號：171224-200403)。③樣本（sample）。火鍋底料均為超市以及商鋪購買的樣品[2]。

2.2 方法

2.2.1 對狀態(tài)進(jìn)行分析

（1） 用 SHISEIDO CAPCELL PAK CR1∶4 (5 μ m、2.0×150 mm）、20 mmol·L-1醋酸銨-乙腈（50∶50）、0.5%的甲酸作 A相、乙腈作為流動相 B相，以0.3 mL·min-1的速度進(jìn)行梯度洗脫，表1為分離生物堿的最佳梯度洗脫表。

表1 分離生物堿的最佳梯度洗脫表

（2）質(zhì)譜學(xué)狀況采用三重四極桿質(zhì)譜計(jì)和電化學(xué)噴射型離子源，采用正離子型采樣方式。套管氣體的氣壓為525 kPa；輔助氣體：6 L·min-1；回流：0.6 L·min-1。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)液的配制

①空白基體。各稱一份與待測組分相同的基質(zhì)，不含被測定組分的樣品，依照被檢樣品的配制步驟，制成空白基體。②標(biāo)準(zhǔn)品。精確稱取適量嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因及那可丁標(biāo)樣，并將其與0.5%甲酸鹽的甲醇水混合制成1 mg·mL-1的溶液，用作標(biāo)準(zhǔn)液。

2.2.3 對試樣進(jìn)行預(yù)處理

稱量樣品2 g，置于具塞的50 mL聚四氟乙烯離心管內(nèi)，加5 mL的水，打圈1 min，然后加15 mL的乙腈，攪拌1 min。在超聲波萃取20 min之后，向其中添加1.5 g的無菌乙酸，然后添加6 g的無水硫酸鎂，使其在漩渦中旋轉(zhuǎn)1 min，然后在4 000 r·min-1的速度下進(jìn)行1 min的離心，然后純化[3]。將50 mg PSA、150 mg的無水硫酸鎂放在具塞的聚四氟乙烯的2 mL離心管中，用1 mL的微量吸管將1 mL以上的上清液放進(jìn)該離心管中，使其旋轉(zhuǎn)1 min，然后在5 000 r·min-1的速度下進(jìn)行1 min的分離，取出上清液0.5 mL在2 mL的離心管內(nèi)，再添加20 mmol·L-1醋酸銨溶液0.5 mL，混勻，過0.45 μm微孔濾膜待測。

2.3 結(jié)果

（1）線性區(qū)間在100 mL的小瓶子中精確地抽出1.00 mL以上的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用稀釋的溶劑（用20 mmol·L-1醋酸銨-乙腈=50∶50作為稀釋溶劑）將其定容至刻度。精密吸取本品1.00 mL于200 mL小瓶子內(nèi)，以稀釋的有機(jī)溶劑定容至刻度，即得對照品[4]。精密吸取上述嗎啡及可待因溶液1.00、1.00、1.00、1.00、2.00 mL和4.00 mL于50、20、10、5、5 mL和5 mL容量瓶內(nèi)，使用稀釋的溶劑將其稀釋到刻度，制成濃度分別為1、2.5、5、10、20 ng·mL-1和40 ng·mL-1溶液；吸取上述蒂巴因、罌粟堿、那可丁溶液0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mL和1.00 mL于50、50、50、50、50 mL和25 mL容量瓶中，用稀釋溶劑稀釋至刻度，制成濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1 ng·mL-1和2 ng·mL-1溶液，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。

表2 5種生物堿標(biāo)準(zhǔn)曲線表

結(jié)果表明，嗎啡、可待因堿性標(biāo)準(zhǔn)為1～40 ng·mL-1，蒂巴因、罌粟堿和那可丁的線性關(guān)系為0.05～2 ng·mL-1，其相關(guān)性大于0.990。

（2）探測極限。以基線的3個(gè)噪音數(shù)值為標(biāo)準(zhǔn)，確定罌粟堿、那可丁和蒂巴因的最低含量為0.1 ng·mL-1，嗎啡和可待因的最小含量是2.5 ng·mL-1。根據(jù)該測定的結(jié)果，本方法罌粟堿、那可丁、蒂巴因的實(shí)際檢出限分別為0.010 μg·kg-1、0.011 μg·kg-1和0.026 μg·kg-1；嗎啡、可待因的實(shí)際檢出限為0.542 μg·kg-1和0.142μg·kg-1。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)結(jié)果滿足方法要求。

（3）準(zhǔn)確度測試用5 ng·mL-1作為基體對照液，測定6個(gè)樣品的峰積，測定其含量，計(jì)算出嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因的相對含量，相對誤差為0.8%～2.3%，具有較好的準(zhǔn)確度。

（4）樣品的加樣加標(biāo)法。每2 g各添加一份標(biāo)準(zhǔn)溶液，按試樣制備中的步驟進(jìn)行測定，并計(jì)算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。用該法進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，得到了滿意的結(jié)果。

（5）方法應(yīng)用。應(yīng)用本方法對餐飲食品中監(jiān)督抽檢的火鍋底料進(jìn)行檢測，方法操作簡單、靈敏度高、信號穩(wěn)定，所得數(shù)據(jù)均能滿足標(biāo)準(zhǔn)要求，為監(jiān)督抽檢任務(wù)奠定基礎(chǔ)。

（6）選取合適的流相組分。由于嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿和那可丁均溶解在甲醇中，因此，在A的流動相A中，采用100%的甲醇。結(jié)果表明，這些化合物的提取效果并不理想。通過對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，流動相為乙酸銨∶乙腈（50∶50），0.5%甲酸為A相，乙腈為流動相B相，得到了不同的結(jié)果。

（7）選取一種樣本萃取液。結(jié)果表明，無論在強(qiáng)酸還是弱堿性環(huán)境下，罌粟皮中的生物堿溶解度均明顯提高，導(dǎo)致嗎啡、可待因、蒂巴因等生物堿在色譜柱上的滯留時(shí)間明顯延長，從而使色譜峰形態(tài)變差，呈現(xiàn)明顯的高、低兩個(gè)峰。結(jié)果表明，在弱堿環(huán)境下，樣品的保持時(shí)間較長，且色譜性能較好。

針對以上問題，本研究擬采用含5種生物堿在弱堿環(huán)境下可溶解于有機(jī)溶劑的特性，采用弱堿環(huán)境下的有機(jī)溶劑萃取罌粟殼多糖，研究其萃取效果。在此條件下，對火鍋湯的樣本進(jìn)行測量時(shí)，應(yīng)當(dāng)將5 g樣本稱取到25 mL的比色管中，在堿性條件下，添加15 mL的純甲醇（添加0.625 mL的氨水），按照以上程序，利用超聲進(jìn)行提取，進(jìn)行定容并搖晃。

（8）確定凈化工藝。由于樣品中含有大量的活性組分，對樣品中的活性組分有很大的影響，因而，對樣品中活性組分的分離就顯得尤為重要。對此，本研究采用MCX色譜對萃取物進(jìn)行了分離，得到了較好的分離純化效果。然而，因其組分比較復(fù)雜，在過固相時(shí)，其流動速度會變得緩慢，且不易進(jìn)行淋洗，處理過程比較煩瑣[5]。PSA是一種極性的吸收劑，它既包含伯胺基，又包含仲胺基，具有很強(qiáng)的陰離子交換能力，對于除去油脂和糖分有著很好的效果，而C18對除去湯料中的顏料有很好的效果。因此，PSA和C18被選作可以除去雜質(zhì)干擾的純化劑。

2.4 討論

（1）對火鍋原料中的罌粟皮含量的測定，參照QuECHERS方法對其進(jìn)行了測定。在生產(chǎn)實(shí)踐中，嗎啡的回收率只有32.5%，且回收率不高。針對傳統(tǒng)的火鍋底料中含有大量生物堿類成分的問題，項(xiàng)目擬采用先用清水從鍋底中浸出的罌粟皮中的生物堿類成分，然后采用乙腈進(jìn)行萃取，并加入無水乙酸，使其從液相向有機(jī)相中遷移，然后用脫水的硫酸鎂除去水相中的水溶液。經(jīng)試驗(yàn)證明，該合成路線能顯著增加提取率，特別是對嗎啡的提取率，達(dá)到了試驗(yàn)要求。

（2）嗎啡等生物堿類為強(qiáng)的化學(xué)成分，采用18-C18柱層析，可獲得較好的分離效果。結(jié)果表明，對嗎啡類的生物堿類化合物，如嗎啡等，在C18柱上幾乎沒有滯留，因而不能進(jìn)行層析。在此基礎(chǔ)上，本研究采用高效的陽離子交換型和反相型C18為填充劑，配比為1∶4的新型高效液相色譜柱，解決了原有的柱效問題，具有重復(fù)性好、滯留時(shí)間長、易于均衡等優(yōu)點(diǎn)，可用于嗎啡等強(qiáng)極性物質(zhì)的高效拆分。

3 結(jié)語

綜上所述，本研究采用了一種混合陽離子MCX的溶膠相萃取柱進(jìn)行分離研究。用該方法對5種物質(zhì)進(jìn)行2 min的快速分離，結(jié)果準(zhǔn)確、快速，且重現(xiàn)性好。因此，本研究成果可用于我國食品中罌粟堿等物質(zhì)的快速準(zhǔn)確分析，具有重要的理論和實(shí)際意義。