不同酵母發(fā)酵對藍莓酒風味影響的研究

◎ 徐子雯，陳舒悅，羅怡婕，周鈺雯，張慧恩

（浙江萬里學院，浙江 寧波 315100）

酒是人類生活中重要的飲品之一。中國酒文化歷史悠久，博大精深，早在幾千年前，中國人就創(chuàng)造出獨特的酒曲復式發(fā)酵法并用于大量釀造黃酒。如今，酒對于中國人來說，已不僅僅是食物，更是一種融合物質生產和精神創(chuàng)作的飲食文化[1-3]。

現(xiàn)代酒類產業(yè)快速發(fā)展，酒類的產量銷量與市場規(guī)模不斷擴大。目前，市場上受歡迎的酒類主要有白酒、啤酒、果酒。在果酒領域內，藍莓酒雖屬小眾品類，但也擁有悠久的釀造歷史，早在明代就有了藍莓酒可美容養(yǎng)顏、抵御濕寒、活血化瘀、強身健體等功效的文獻記錄。因此，自古以來，藍莓酒就被認為具有美容的神奇功效，并一直流傳至今?，F(xiàn)代科學已經確定，經過發(fā)酵后的藍莓酒可以刺激更多活性成分的產生，藍莓酒不僅味道比藍莓和藍莓汁更吸引人，而且其含有的花青素和其他營養(yǎng)物質更易被身體吸收。相較于其他的酒類，飲用藍莓酒更有利于身體健康。在歐洲，藍莓酒被譽為“給人類壽命帶來第三次飛躍”的神奇之物。不同于在歐洲的知名度，藍莓酒在中國是個鮮為人知的小眾酒類，遠不如葡萄酒的市場知名度。由于最近幾年酒類市場迎來消費升級轉型，使得市場更偏年輕化，更易接受新奇酒類，消費者更加注重酒類風味多樣化、低酒精度數(shù)及健康飲酒，藍莓酒因此打開了中國市場[4]。

當前，頂空固相微萃取-氣質譜聯(lián)用（HSSPME-GC/MS）技術已應用于各種類型酒樣（如葡萄酒、紅酒和白酒等）中揮發(fā)性香氣成分的分析[5]。此外，主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判別分析（PLSDA），都是利用原始數(shù)據(jù)呈現(xiàn)組間及組內差異的可視化技術，可從不同維度反映不同樣本間的代謝組成的差異[6]。

雖然近幾年酒類風味物質的研究受到學者的高度關注，但是相較于其他酒類，藍莓酒的相關研究還比較少。盡管近幾年藍莓酒越來越受到消費者的青睞，但是少有聚焦于藍莓酒中揮發(fā)性風味物質和藍莓酒的主要香氣特征的研究?；诖?，本文利用氣相色譜質譜聯(lián)用儀結合代謝組學對不同酵母發(fā)酵藍莓酒風味物質的影響進行研究，旨在全面了解和認識不同酵母對于藍莓酒風味物質的基礎差異，從而選擇最適合釀造藍莓酒的釀酒酵母，為以后有關藍莓酒香氣物質的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

氣相色譜質譜聯(lián)用儀8890-5977B（安捷倫公司）；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相萃取頭及萃取手柄（美國 Supelco公司）；電子天平B124S（賽多利斯有限公司）；磁力加熱攪拌器RT2（賽默飛公司）。

1.2 材料與試劑

藍莓：購于奉化藍莓基地，充分成熟，采摘后立即于-18 ℃保存；酵母AU、DE、RA購自煙臺帝伯仕自釀機有限公司；氯化鈉（分析純）購于國藥集團。

1.3 試驗方法

1.3.1 藍莓酒的發(fā)酵工藝流程

基本工藝流程：藍莓果→挑選→解凍→打漿→調整成分（添加偏重亞硫酸鉀、蔗糖、碳酸鈣）→接種酵母→裝罐→主發(fā)酵→倒罐→陳釀→成品酒。

1.3.2 揮發(fā)性風味物質的測定

萃取條件：取5.0 mL藍莓酒樣，加入20.0 mL頂空瓶中，加入1 g NaCl，在水浴鍋中50 ℃平衡10 min，將SPME手動進樣柄（萃取頭型號：50/30 μm PD-MS/DVB/CAR）插入進樣瓶中，50 ℃萃取30 min，取出萃取頭插入氣相色譜儀進樣口，解析5 min后取出[7-8]。

GC 條件：HP-5MS 色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），不分流進樣，柱溫采用程序升溫，50 ℃保持1 min，以5 ℃/min升至90 ℃保持1 min，再以1 ℃/min升至100 ℃保持3 min，再以2 ℃/min升至120 ℃保持1 min，最后以6 ℃/min升至250 ℃。進樣口溫度250 ℃，載氣為氦氣，流速1.0 mL/min[9-10]。

MS 條件：電離方式 EI，電離電壓 70 eV，離子源和四極桿的溫度分別為230 ℃和150 ℃燈絲電流 0.25 mA，電子倍增器電壓為1 500 V，掃描范圍40～550 m/z[11]。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

①定性分析。通過檢索與NIST17標準譜庫進行比對，選擇匹配度≥70%的物質為有效物質。②定量分析。采用峰面積歸一法計算。③主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別分析（PLS-DA），由MetaboAnalyst網站進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同酵母藍莓酒風味物質分析

（1）利用GC-MS對3組不同酵母發(fā)酵的藍莓酒中的風味物質進行采集和數(shù)據(jù)分析。經NIST 17.0數(shù)據(jù)庫檢索后，共鑒定出76個化合物（見表1）。按照其化學結構性質可分為5類，包括有機酸類、酯類、醇類、萜烯類、酚類。其中，醇類26種，酯類15種，酸類15種，萜烯類13種，酚類7種。3種酒中醇類和酸類物質占比最多，其次是酯類。醇類物質是果酒香氣的主要成分，醇類物質能夠促進酯類物質香氣成分的散發(fā)，使酒體更加飽滿[12-13]。

（2）3 種酒樣含量較高的主要香氣成分為異戊醇、苯乙醇、異丁醇、芳樟醇、α-松油醇。異戊醇具有酒精味和特殊的指甲油的味道[14]；芳樟醇和苯乙醇具有玫瑰花香[15]。RA酵母釀造藍莓酒中醇類占比最高，對感官風味影響較大；DE釀造的藍莓酒醇類物質含量最低，這是由于釀酒所用酵母不同導致的。

（3）酯類是賦予果酒豐富果香、花香的物質，與果酒整體風味的呈現(xiàn)具有重要關系。藍莓酒中主要酯類物質有丁二酸二乙酯、乙酸異戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯等，這些酯類物質增加了酒體的果香與花香。結果顯示，AU酵母釀造藍莓酒中酯類占比最高，其次是DE。

（4）藍莓酒中含有較多的有機酸，主要來自藍莓鮮果。有機酸能夠影響藍莓酒的酸甜比，對酒的口感具有較大影響。當酸類含量過高時，會大大降低果酒的香味，口感舒適度降低；當酸類含量較低時，能夠帶來清爽的口感，增加酒體的復雜性。相比較DE釀造的藍莓酒有機酸含量最低，AU釀造的藍莓酒有機酸含量有所增加。

2.2 藍莓酒風味物質PCA和PLS-DA分析

（1）PCA分析是無監(jiān)督的，即PCA分析并不考慮樣品的分組信息。PCA的目標是選擇幾個相互獨立的因子代表所有代謝物，這些因子保留了關于原始代謝物變異的最大信息量。對此，本研究選擇保留最多信息的2個因子，并構建一個散點圖，顯示一組代謝物的樣本之間的結構差異[16]。

（2）進行PCA主成分分析利用之前提取到的化合物，了解三組藍莓酒之間的總體化合物表型差異。結果表明，3種不同酵母的藍莓酒前2個主成分PC1和PC2的累計方差貢獻率達69.7%（如圖1），這說明主成分很好地概括了樣品的原始數(shù)據(jù)信息。其中，PC1占48.5%，PC2占21.2%。PCA模型包含4個主成分，擬合參數(shù)為R2X=0.924、Q2=0.860，圖中3組樣品明顯分布在不同區(qū)域，區(qū)分顯著，說明3種藍莓酒的風味物質組成結構差異。

圖1 PCA主成分分析得分圖

（3）除了無監(jiān)督模式的主成分分析PCA以外，本試驗還使用Metaboanalyst對所有樣本建立偏最小二乘判別分析（PLS-DA）。判別最小二乘分析是受控的，即分析時需要聚類信息，PLS-DA可用于尋找樣本組間最大可能差異的因子。判別分析將要預測的連續(xù)分類變量編碼為潛變量，在解釋變量和潛變量之間建立回歸，并使用最小二乘回歸理論求解。PLS-DA通過將預測變量和觀測變量分別投射到一個新的空間來尋找線性回歸模型，這表明PLS-DA模型的判別能力更強[17]。其中，變量重要性因子（VIP）可以量化每個變量對分類的貢獻。當 VIP 值>1 時，對應變量可定義為判別模型的關鍵變量，VIP值越大，對模型的重要性越大[18]。

PLS-DA的得分圖（見圖2）表明3組藍莓酒有明顯的分離，PC1和PC2分別解釋了總方差的46.3%和23.0%，3組藍莓酒的點云分布在不同的區(qū)域，PLSDA 模型包含2個主成分，擬合參數(shù)為R2X=0.825、Q2=0.629。R2X越接近1表明模型越穩(wěn)定，Q2>0.5 表明預測率較高[19]。

圖2 PLS-DA分析得分圖

根據(jù) VIP 值（VIP>1）和P值（P<0.05）篩選出關鍵揮發(fā)性成分，結果顯示共篩選出15種差異揮發(fā)性物質（見圖3）。其中，有機酸4種，酯類2種，醇類3種，萜烯類4種，酚類2種。分別為己酸、辛酸、壬酸、3-氨基丁酸、乙酸異戊酯、丁二酸二乙酯、異丁醇、異戊醇、苯乙醇、薄荷醇、芳樟醇、α-松油醇、4-萜品醇、2,4-二叔丁基酚、3,5-二叔丁基苯酚。

圖3VIP圖

2.3 藍莓酒的感官評價

感官品評是評價食品感官質量最有效、最直觀的方法，特別是在酒類食品中，感官評價是任何先進儀器無法替代的[20]。本次試驗將綜合10名受過訓練的食品專業(yè)學生的得分求取平均值，盡量減小試驗誤差。由表2可知，藍莓酒外觀澄清透明，呈寶石紅色。其中，AU藍莓酒顏色為悅人深紫寶石紅色，果香濃郁，平衡性好；DE藍莓酒果香濃郁但顏色較淺；RA藍莓酒顏色悅人但協(xié)調性略顯薄弱。綜合相關評語和得分可以看出，AU藍莓酒從色澤、香氣、口感和典型性方面表現(xiàn)突出、果香濃郁、協(xié)調性好、品質最佳。感官評價得分如2.2所述，本研究根據(jù) VIP 值（VIP>1）和P值（P<0.05）篩選出關鍵揮發(fā)性成分存在一定的內在聯(lián)系，其中，α-松油醇VIP值最大，在AU藍莓酒中含量最高，可能是影響感官評價得分的關鍵物質。

表2 不同酵母藍莓酒感官評價表

3 結論

本研究采用3種不同酵母釀造的藍莓酒，通過頂空固相微萃取-氣質譜聯(lián)用（HS-SPME-GC/MS）技術共鑒定揮發(fā)性化合物76種，經數(shù)據(jù)處理歸納總結后可以發(fā)現(xiàn)，有3種不同酵母的藍莓酒間有41種相同的化合物，說明3種藍莓酒的揮發(fā)性風味物質在種類上具有一定的差異性。在此基礎上，本研究利用PCA和PLSD-DA對風味物質進行分析，均能驗證3組藍莓酒存在整體差異，能夠被完全區(qū)分開來，并找出15種差異風味物質，其中，α-松油醇VIP值最大。從感官評價來看，AU藍莓酒得分最高，RA藍莓酒得分最低，原因在于AU藍莓酒中α-松油醇含量最高，可能對風味起著較為顯著的作用。綜上所述，AU酵母比其余2種酵母更適合用于釀造藍莓酒。