熒光定量PCR 與全自動生物芯片法檢測人乳頭瘤病毒的一致性研究

胡海旭，馬春輝,2，張麗娟，劉 毅,2，劉天懿

1 解放軍總醫院第五醫學中心腫瘤醫學部研究所，北京 100071；2 安徽醫科大學基礎醫學院，安徽合肥 230032；3 解放軍總醫院第五醫學中心中醫科，北京 100071

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤[1-2]，其發病原因已明確是人乳頭瘤病毒(human papillomaviruses，HPV)的持續感染[3-4]，這為患者的早期篩查和疫苗預防提供了良好的機會[5]。目前已經確認的HPV 類型有170 余種，其 中HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV82 和HPV83 等型別與宮頸癌的發生密切相關，被統稱為高危型HPV，而HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV44 和HPV81 等則屬于低危型病毒，與生殖器疣的發生有關[6-7]。通過分子生物學方法進行HPV 病毒的檢測是宮頸癌早期篩查的有效手段，常用的技術包括雜交捕獲、熒光定量PCR、導流雜交和環介導的等溫擴增[8-14]等。然而，上述方法一般都是采用手工進行試劑分裝和核酸提取加樣，對于樣本量大且型別多的HPV 檢測，整體工作量非常繁重。此外，基層醫療機構雖然在宮頸癌早期篩查中承擔了重要職責，但大多數并不具備開展分子檢測所必需的PCR 實驗室條件。為了避免以上因素給宮頸癌早期篩查工作所帶來的不利影響，本研究嘗試測試一種全自動的HPV 檢測方法。本文將介紹該方法與傳統熒光定量PCR方法進行對比分析的結果。

材料與方法

1 取樣及存儲 選取2021 年4 -12 月于解放軍總醫院第五醫學中心南院區進行HPV 常規檢測的宮頸脫落細胞樣本共計4 589 例，被檢者年齡20～82 歲，采用宮頸取樣器刷取宮頸脫落細胞，放入帶有保存液的無菌存儲管中，盡快送檢。樣本4℃保存，3 d 內完成熒光定量PCR 檢測，剩余的樣本-20℃保存直至進行全自動生物芯片法檢測。

2 熒光定量PCR 檢測 4 589 例宮頸脫落細胞樣本均進行熒光定量PCR 檢測，采用高危型HPV 分型核酸測定試劑盒(上海之江)，根據廠家說明書進行操作，具體步驟：樣本充分混勻，吸取500 μL加入1.5 mL EP 管中，13 000 r/min 離心5 min，棄去上清并加入1 mL 0.9%氯化鈉注射液，混勻后再次以13 000 r/min 離心5 min。棄去上清，加入100 μL 核酸提取試劑，充分混勻，在100℃金屬浴上靜置10 min。之后以13 000 r/min 離心5 min，上清作為模板用于PCR 檢測。對于每一份樣本(或陰陽性質控)，在4 個單獨的反應管中各配置36 μL 的反應混合液，然后加入4 μL 模板和0.4 μL酶，充分混勻并簡單離心之后在SLAN-96 P 熒光定量PCR 儀上進行檢測。4 個反應管分別檢測HPV 16/56/31/內參，HPV 18/52/58/68，HPV 45/82/33/35 以及HPV 39/51/59/66(以上數字為HPV 的各種類型)。具體反應條件：94℃ 2 min；93℃ 10 s，62℃ 31 s，40 個循環；62℃時在每個反應管中采集FAM/VIC/ROX/CY5 熒光信號。質控合格的情況之下，根據循環閾值(cycle threshold，Ct) 進行樣本的結果判讀：Ct≤40 為陽性，Ct＞40 為陰性(Ct 值為38～ 40 時需經過重復確認)。

3 全自動生物芯片法檢測 針對完成熒光定量PCR 檢測的樣本，每一種HPV 型別均采用抽簽法進行簡單隨機抽樣。采用全自動生物芯片法HPV 核酸檢測試劑盒(博暉創新)，根據廠家說明書對選中的樣本進行檢測，步驟如下：打開核酸芯片檢測儀，將試劑盒內的各組分充分平衡至室溫并混勻，依次放置在檢測儀試劑區的對應位置，將芯片安裝到位。將凍存的樣本室溫下融化，充分混勻之后吸取200 μL 加入到芯片的加樣孔，關閉儀器艙門，運行自動化檢測程序。機器將自動完成核酸提取、PCR 擴增和反向斑點雜交等步驟，期間無須操作人員值守。檢測結束后程序自動報告判讀結果，操作人員可根據表1 所示探針分布情況進行結果復核：在空白對照、陰性對照、內參質控和顯色質控結果合格的前提下，在相應位置出現顯色斑點即為某種型別陽性。

表1 芯片上的探針分布情況Tab.1 Distribution of the probes on the chip

4 結果不符樣本的測序驗證 針對兩種方法檢測結果不符的樣本，在相應型別的E6/E7 區域設計引物。其中39、52 和68 型的引物位于其E6 區，而59 的引物位于其E7 區，具體序列見表2。上述型別的PCR 反應體系均為30 μL，包括上下游引物混合液2 μL，模板DNA 4 μL，反應混合液7.5 μL 以及水16.5 μL。PCR 擴增反應的條件：95℃ 10 min → 94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，重復40 個循環 → 72℃ 2 min。擴增結束之后，電泳確認條帶位置正確，將產物送至天一輝遠公司進行一代測序驗證。

表2 測序分析中所用到的引物序列Tab.2 Primers in sequencing analysis

5 統計學分析 采用SPSS 24.0 軟件進行統計學分析。以熒光定量PCR 方法的結果作為參照，計算全自動生物芯片法的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和總體符合率。采用Kappa 檢驗分析兩種方法檢測結果的一致性，Kappa 值為0.81～ 1.00 被認為一致性很好，采用配對χ2檢驗進行方法間的優勢性檢驗統計推斷。P＜0.05 為差異有統計學意義。

結果

1 樣本整體情況 經熒光定量PCR 檢測，4 589例宮頸脫落細胞樣本陽性率為19.4%(892/4 589)，其中單一型別陽性689 例(15.0%)，混合兩種以上型別陽性203 例(4.4%)。最常見型別為52 型(227 例)、58 型(163 例)和16 型(155 例)，較為稀有型別為45 型(14 例)、82 型(21 例)和68 型(22 例)。

采用抽簽法進行簡單隨機抽樣，選取了124例標本用于全自動生物芯片法的對比研究，其中陰性標本50 例，陽性標本74 例。在陽性樣本中，單一型別的55 例，混合2 種型別的14 例，混合3 種型別的4 例，混合4 種型別的1 例。上述標本按照陽性型別計數共計有99 個測試，其中18、31、45、66、68 型的測試均為5 個；16、33、39、56、59 型的測試均為6 個；35、51 型的測試均為7 個；82 型、58 型和52 型的測試分別有8 個、9 個和13 個。

2 兩種檢測結果的對比 在對比測試中，所有樣本及其質控結果均合格有效。見表3。

表3 熒光定量PCR 與全自動生物芯片法檢測結果的對比Tab.3 Comparison of results between fluorescent quantitative PCR (qPCR) and automatic bio-chips method

按照樣本進行計算(陽性標本74 例，陰性標本50 例)，兩種方法的結果完全一致，Kappa 值為1.000(P＜0.000 1)。

按照型別進行計算(樣本量或陽性陰性標本數見上節)，以熒光定量PCR 法為參照，全自動生物芯片法的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和總體符合率分別為98.0%、92.6%、96.0%、96.2%和96.1%。兩種方法整體比較的Kappa 值為0.913，提示結果一致性良好。

其中，兩種方法在HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV51、HPV56、HPV58、HPV66 和HPV82 型中的檢測結果完全一致。此外，39 型和59 型各有1 例測試不一致，均為熒光定量PCR 法檢測陽性但全自動生物芯片法檢測陰性。52 型和68 型各有2 例測試不一致，均為熒光定量PCR 法檢測陰性但全自動生物芯片法檢測陽性。全自動生物芯片法還額外發現了18 例其他型別，分別為低危的6 型1 例、42 型3 例、43 型1 例、44 型3 例、81 型5 例，以及高危的53 型4 例和73 型1 例，上述型別并未涵蓋在熒光定量PCR 法的檢測范圍之內。

統計推斷結果：關聯性檢驗均P＜0.05，提示關聯性顯著，即按樣本或按型別測試的結果，均與qPCR(參照) 結果相對一致；優勢性檢驗均P＞0.05，提示按樣本或按型別的測試，與qPCR法相比，優勢差(差異)不顯著。

3 不一致結果的分析 如表4 所示，兩種檢測方法不一致的結果涉及6 例樣本(13、28、70、84、97 和105 號樣本)的4 種型別。上述樣本均進行了重復性驗證及測序分析(圖1)，確認結果無誤。經仔細對比后發現，兩種檢測方法只是在某個型別上存在偏差，對樣本的陰陽性判斷仍保持一致。其中13、28、97 號樣本不一致型別的熒光定量PCR Ct 值略高于40，提示可能是因為核酸提取或加樣量的差異所導致的結果偏差；而70、84 和105 號樣本均混合了多個型別，推測可能是因為這些型別的引物或探針序列之間存在相互干擾，對其擴增效率造成了不利影響。

圖1 不一致結果的測序分析。自上而下分別為39、52、59 和68 四種型別的典型測序結果，證實對應的樣本確實為該型別陽性Fig.1 Sequencing analysis of inconsistent results.From above to the bottom was the result of 39,52,59 and 68 type,respectively,demonstrating the samples were positive for each type

表4 兩種檢測方法不一致結果的對比Tab.4 Comparison of inconsistent results by the two methods

討論

宮頸癌的發生與HPV 的持續感染密切相關，因此HPV 的分型檢測在宮頸癌的篩查和預防過程中具有重要的作用[1-4]。熒光定量PCR 是最常用的HPV 檢測手段之一，具有敏感性和特異性俱佳等優勢。然而，該方法對于操作人員和實驗場地有較高的要求，不利于基層醫療機構開展。另外，由于整個過程的人工操作較多，單批次24 人份的檢測至少需要1 h 以上的處理時間。為嘗試解決上述問題，本研究對一種全自動生物芯片法進行了測試和對比。該方法將核酸提取、純化、PCR 擴增、反向斑點雜交檢測和結果判讀都整合在一臺儀器之中完成。在聚苯乙烯柔性層構成的泵/閥裝置的推動之下，待檢樣品可以依次通過芯片的準備區，擴增區和分析區，整個過程一直處于密閉狀態，不會產生氣溶膠污染，因此對實驗場地并沒有過高的要求[15]。本研究結果顯示，全自動生物芯片法的準確性非常理想，尤其是陰陽性判斷時，全自動生物芯片法與目前常規使用的熒光定量PCR 法完全符合。

全自動生物芯片法采用了DNA 反向斑點雜交，在雜交膜的相應位置出現藍色的斑點即可判斷相應的型別為陽性，該方法的優勢是僅需一個擴增反應，檢測的型別更多，能夠覆蓋最常見的高危型(18 種)和低危型(6 種) HPV[15]。而本研究所采用的熒光定量PCR 方法則是通過TaqMAN 熒光探針來實現分型，其優勢是特異性好，但因為熒光通道的限制，需要至少4 個反應管才能完成15 種常見高危型的區分，低危型還需通過另外一個試劑盒進行檢測[14]。在本研究所納入的124 份樣本中，全自動生物芯片法在熒光定量PCR 方法所檢測的15 種高危型之外還多發現了18 例其他型別，其中低危型13 例，高危型5 例，最常見的是低危的81 型(5 例)和高危的53 型(4 例)。這一結果提示，檢測更多的型別還是非常有必要，雖然某些型別的整體陽性率并不高，但考慮到我國龐大的人口基數，如果不將其納入檢測，將會有大量人員漏檢，影響臨床決策的制定。此外，一次采樣同時完成高危型和低危型HPV 檢測也有助于降低醫療資源消耗和待檢人員的經費支出，具有良好的經濟效益。

本研究所采用的兩種檢測方法的引物和探針都是設計在HPV 基因組的L1 保守區，該區域負責編碼HPV 的衣殼蛋白，但在病毒基因組整合進宿主之后，該段序列將有可能丟失，這會影響檢測的準確性。近期，很多檢測方法都是將引物和探針設計在HPV 基因組的E6/E7 區域，與L1 保守區所不同的是，該區域在感染的整個過程之中都持續存在，是維持HPV 惡性表型的關鍵[16]。為解釋出現偏差的型別，本研究在相關型別的E6/E7 區域設計了引物并進行了擴增測序，結果證實確實存在相應的型別，兩種方法的結果都并非假陽性。經過進一步對比發現，3 例樣本不一致型別的熒光定量PCR Ct 值略高于40(這是根據內參基因的檢出情況而校正的結果)，另外3 例樣本均混合了多個型別，因此推測結果的偏差可能是因為核酸提取、加樣量和多個型別擴增效率方面的差異引起。令人欣慰的是，兩種方法在這6 例樣本中盡管存在1 個型別的不一致，但整體陰陽性的判讀并未出現偏差。如果忽略具體型別，只按照陰陽性進行對比，兩種方法符合率可達100%。

根據熒光定量PCR 方法常規檢測的結果，最常見的是HPV52、HPV58 和HPV16 型，這與之前大樣本量的中國人群數據吻合[17-18]；最少見的則是HPV45、HPV82 和HPV68 型，在9 個月內只積攢到20 例左右(含混合型)。作為一個初步的對比研究，每個型別都確保至少有5 個測試，共計完成了99 個測試。盡管整體的對比效果非常理想，但由于樣本總例數相對較少，個別樣本的偏差將有可能導致數據的大幅波動，這是本研究的主要不足之處。

綜上，經對比研究發現，全自動生物芯片法與熒光定量PCR 法在HPV 的分型檢測中具有很好的一致性。此外，全自動生物芯片法還具有節省人工操作、無需專業PCR 實驗室、能夠覆蓋更多型別等優勢，對于技術人員不足及缺乏實驗室條件的醫療機構來說，該方法有望成為HPV 分型檢測的有效解決方案。

作者貢獻胡海旭：實驗指標檢測，實驗數據分析處理，論文初稿撰寫；馬春輝：實驗指標檢測；張麗娟：實驗樣本收集；劉毅：總體構思，監督指導，審讀，修訂；劉毅：申請獲取項目基金和出版基金資助，獲取項目所需資料；劉天懿：監督指導。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

數據共享聲明本論文相關數據可依據合理理由從作者處獲取，Email：huhaixu1007@sina.com。