外周血線粒體DNA D 環區甲基化及拷貝數與帕金森病相關性研究

袁 瑞，趙艷青，張中奇，王麗珍，楊志甫

1內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院神經內科，內蒙古包頭 014000；2 內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院神經外科，內蒙古包頭 014000；3 內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院病理科，內蒙古包頭 014000；4 內蒙古科技大學包頭醫學院基礎醫學與法醫學院病理教研室，內蒙古包頭 014000

帕金森病(Parkinson's disease，PD) 又稱震顫麻痹，是一種主要影響患者運動系統的神經退行性疾病，多發生于中老年人群[1]。PD 的病因和發病機制尚不清楚。目前認為，PD 是在老齡化背景下，遺傳因素和各種環境因素綜合導致的結果。而在遺傳與環境因素之間起重要橋梁作用的表觀遺傳學修飾，近年來已成為神經退行性疾病的一個重要研究領域[2]。DNA 甲基化是最重要的表觀遺傳學修飾方式之一[3]。近年來，有關DNA 甲基化與PD 相關性的研究主要集中于細胞核DNA[4]；而線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)甲基化是一個新的領域。線粒體作為細胞的關鍵細胞器，在細胞周期調節、細胞能量代謝、細胞分化、細胞凋亡、產生活性氧等方面起著至關重要的作用[5]。線粒體的結構和功能由核基因組和mtDNA 共同編碼。研究表明，mtDNA 的異常甲基化可引起線粒體功能障礙[6]。而線粒體功能障礙是神經退行性疾病發病的主要原因之一，在PD的發生中發揮重要作用[7]。目前關于mtDNA 甲基化與PD 相關性的研究并不多，且由于研究對象、樣本數量和研究方法的差異，結果也存在矛盾之處[8-10]。因此本研究采用病例-對照研究，通過比較PD 患者與健康體檢者外周血mtDNA D 環區的甲基化水平及mtDNA 拷貝數的差異，分析二者的相關性，以期從mtDNA 甲基化調控的角度探討PD 的發病機制。

對象與方法

1 研究對象PD組選自2020 年8 月-2022 年2 月在內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院神經內科住院及門診就診的30 例PD 患者，男性、女性各15 例，平均年齡(66.63 ± 7.95)歲，均符合《中國帕金森病的診斷標準(2016 版)》中PD 的臨床診斷標準[11]。排除標準：(1)繼發性及遺傳性帕金森病綜合征、帕金森疊加綜合征、特發性震顫；(2)惡性腫瘤、嚴重心肺肝腎疾病等嚴重軀體疾病及精神疾病；(3) 癲癇、藥物或乙醇依賴者；(4)嚴重癡呆不能配合的患者。正常對照組選擇同期在內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院體檢的30 例健康體檢者，男性、女性各15 例，平均年齡(63.50 ± 4.96)歲。對照組納入病史及體格檢查中無顱腦疾病證據和(或) 頭顱MRI/CT 正常者；排除患惡性腫瘤、高血壓、糖尿病、嚴重心肺肝腎疾病等嚴重軀體疾病及精神疾病者。由本課題組中主治醫師以上職稱的神經內科醫師對所有受試者進行詳細病史采集及體格檢查，記錄各項臨床資料。PD 患者還采集患病時間、Hoehn-Yahr 分期等。所有患者均簽署知情同意書，本研究經內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院倫理委員會審核批準(包醫倫審2022 第20 號)。

2 質譜法(MassARRAY) 檢測mtDNA D 環區甲基化 所有受試者抽取清晨空腹肘靜脈血2 mL，按照血基因組DNA 試劑盒提取全血標本DNA。采用NaHSO3試劑盒處理待檢測DNA 樣本，配制CT 混合液：ddH2O 9 mL；M-Dilution Buffer 3 mL；M-Dissolving Buffer 500 μL，98℃ 10 min；64℃30 min，共5 個循環；4℃保存。上述樣本純化后配制PCR 反應體系：ddH2O 6.4 μL；10 × PCR Buffer 1 μL；dNTPs 1 μL；PCR Enzyme (5 U/μL)0.2 μL ；Forward Primer (10 pmol/μL) 0.2 μL；Reverse Primer (10 pmol/μL) 0.2 μL；DNA Template 1 μL，按PCR 反應條件94℃ 4 min，94℃ 20 s；56℃ 20 s；72℃ 1 min，共45 個循環，72℃ 3 min進行擴增。具體引物序列見表1。進行SAP 酶反應體系及轉錄酶切反應，采用Agena NanodispenserRS1000 點樣儀，將樹脂純化后的產物移至384-well SpectroCHIP? bioarray，檢測結果使用EpiTYPERTM軟件進行分析。

表1 引物序列Tab.1 Primers used in the experiment

3 實時定量PCR 分析(qRT-PCR)檢測mtDNA 拷貝數 所有受試者抽取清晨空腹肘靜脈血2 mL，按照血基因組DNA 試劑盒提取全血標本DNA。采用瓊脂糖電泳和Nano OD 檢測DNA 樣本濃度。將DNA 原液加無菌超純水稀釋5 倍備用，引物參考文獻[12]中使用的核DNA 區域的血紅蛋白亞基β(hemoglobin subunit β)和mtDNA區域的特異性引物(chrM：3 313～ 3 322)，具體序列見表1。配置實時熒光定量PCR 體系：qpcr SYBR Green Master Mix 10 μL；ddH2O 8.2 μL；Forward Primer(10 μ mol/L) 0.4 μL；Reverse Primer (10 μmol/L)0.4 μL；DNA Template 1 μL；PCR 反應條件: 預變性95℃ 5 min；變性95℃ 10 s；退火55℃ 20 s；延伸72℃ 20 s，共40 個循環，溶解曲線階段以儀器默認設置為主。CT 值計算(2-ΔΔCT計算法)：以hemoglobin subunit β 為內標基因，ΔCT=CTchrM-CThemoglobinsubunitβ，ΔΔCT=ΔCTPD-ΔCT對照，目的基因的表達量用2-ΔΔCT描述。

4 統計學分析 所有資料采用SPSS 20.0 軟件進行統計分析。應用KLolmogorov-Smimov 法進行正態性檢驗，符合正態分布的計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗；mtDNA D 環區甲基化水平與mtDNA 拷貝數相關性采用Pearson 相關分析；PD 發病影響因素分析采用二元Logistic 回歸；P＜0.05 為差異有統計學意義。采用GraphPad Prism 6 軟件作圖。

結果

1 PD 組與對照組一般資料比較 兩組在性別、年齡、體質量指數、吸煙與飲酒史、空腹血糖、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇、三酰甘油、肌酐、尿素、尿酸等的差異均無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

表2 PD 組與對照組一般資料比較Tab.2 Comparison of general information between the PD patients and the healthy controls

2 PD 組與對照組mtDNA D 環區甲基化率比較外周血mtDNA D 環區共檢測CpG 位點18 個；PD 組D 環區每個CpG 位點的甲基化率為14%～28%，而對照組為13%～ 33%，差異無統計學意義(t=-0.264，P=0.793)，見圖1、圖2 及表3。依據其H-Y 分期將PD 組分為早期組、中晚期組，早期PD 患者10 例，中晚期PD 患者20 例，兩組間外周血mtDNA D 環區總體甲基化率及各CpG 位點甲基化率差異亦無統計學意義(t=-0.705，P=0.487)，見表4、圖2。

圖1 外周血mtDNA D 環區18 個CpG 位點的甲基化測序結果圖Fig.1 Sequencing results of the 18 CpG sites of D-loop region in peripheral blood

圖2 外周血D 環區體甲基化率比較 A：PD 組與對照組外周血D 環區18 個CpG 位點的總體甲基化率比較；B：PD 組與對照組外周血D 環區各CpG 位點的甲基化率比較；C：早期與中晚期PD 患者外周血D 環區總體甲基化率比較；D：早期與中晚期PD 患者外周血D 環區各CpG 位點的甲基化率比較Fig.2 Comparison of the methylation of D-loop region in peripheral blood A: Comparison of the overall methylation of D-loop region in peripheral blood between the PD patients and the controls;B: Comparison of the methylation of each CpG site of D-loop region in peripheral blood between the PD patients and the controls;C: Comparison of the overall methylation of D-loop region in peripheral blood between early and mid-to late-stage PD patients;D: Comparison of the methylation of each CpG site of D-loop region in peripheral blood between early and mid-to late-stage PD patients

表3 PD 組與對照組mtDNA D 環區甲基化率比較(%)Tab.3 The methylation level of D-loop region between the PD patients and the healthy controls (%)

表4 早、中晚期PD 組D 環區甲基化率比較(%)Tab.4 The methylation level of the D-loop region between early and advanced PD patients (%)

3 PD 組與對照 組mtDNA 拷貝數比較PD 組外周血mtDNA 拷貝數低于對照組(0.84 ± 0.30vs1.11 ± 0.52，P=0.020)。中晚期PD 組外周血mtDNA拷貝數低于早期PD 組(1.03 ± 0.28vs0.75 ± 0.07，P=0.012)。見圖3。

圖3 外周血mtDNA 拷貝數比較A：PD 組與對照組外周血mtDNA 拷貝數比較；B：早期PD 與中晚期PD 組外周血mtDNA 拷貝數比較Fig.3 Comparison of the mtDNA copy numbers in peripheral bloodA: Comparison of the mtDNA copy numbers in peripheral blood between PD patients and the controls;B: Comparison of the mtDNA copy numbers in peripheral blood between early and mid-to late-stage PD patients

4 外周血D 環區甲基化率與mtDNA 拷貝數的相關性 Pearson 相關分析顯示，所有研究對象外周血D 環區第1、15 個CpG 位點(人mtDNA 序列第112、413 位核苷酸)甲基化率與其mtDNA 拷貝數呈負相關(r=-0.257，P=0.047；r=-0.517，P＜0.001)，其余各CpG 位點甲基化率及總體甲基化率與其mtDNA 拷貝數均無相關性(P＞0.05)。見圖4。

圖4 外周血D 環區第1 個(A)、第15 個(B) CpG 位點甲基化率與mtDNA 拷貝數Pearson 相關分析Fig.4 Correlation analysis of the methylation of the CpG sites 1(A),15 (B) of D-loop region with the mtDNA copy number in peripheral blood

5 PD 發病關聯因素回歸分析 以是否患PD 為因變量，將兩組間有統計學差異的mtDNA 拷貝數及與其呈負相關的D 環區第1、15 個CpG 位點甲基化率以及文獻中提到可能與PD 發病有關的年齡、性別、吸煙、飲酒等因素作為自變量進行二元Logistic 回歸分析，結果顯示mtDNA 高者PD發病概率低(OR=0.119，P=0.023)。見表5。

表5 PD 發病關聯因素二元回歸分析Tab.5 Bivariate logistic regression analysis of factors associated with PD

討論

近年來，有關DNA 甲基化與PD 相關性研究多集中于細胞核DNA，而mtDNA 甲基化是一個新領域。我們發現PD 組外周血D 環區總體甲基化率及各CpG 位點甲基化率與對照組相比無統計學差異；而PD 組外周血mtDNA 拷貝數低于對照組，且其隨著PD 病程進展呈動態變化，是PD 發病的保護因素；外周血mtDNA D 環區第1、15個CpG 位點甲基化率與mtDNA 拷貝數呈負相關。

線粒體D 環區是mtDNA 復制和轉錄的調控中心，其突變可以引起許多線粒體疾病[5]。目前，mtDNA 甲基化調控方面的研究也多集中于D 環區。研究發現，攜帶SOD1 或C9orf72 突變的肌萎縮側索硬化癥患者外周血[13]、AD 患者外周血及腦組織[9,14]、APP/PS 1 雙轉基因AD 小鼠模型的海馬組織[15]等標本中mtDNA D 環區的甲基化水平均發生顯著改變。Blanch 等[9]發現，PD 患者黑質mtDNA 中D 環區甲基化水平顯著低于對照組。而Stoccoro 等[10]發現，PD 組與對照組外周血D 環區甲基化水平無統計學差異，且左旋多巴治療和病程對PD 患者的D 環區甲基化水平也沒有影響。本研究采用目前DNA 甲基化檢測金標準之一的MassARRAY 技術檢測PD 組與對照組外周血D 環區甲基化水平，發現兩組外周血D 環區總體甲基化率及各CpG 位點甲基化率差異無統計學意義，與Blanch 等[9]的研究結果不一致，考慮與納入研究對象的標準、采集的標本及研究方法不同有關。

mtDNA 拷貝數改變是影響線粒體功能的重要因素，是目前神經退行性疾病研究中一個重要課題。研究發現D 環區突變及甲基化、線粒體自噬異常和mtDNA 復制轉錄因子下調可導致mtDNA拷貝數下降[16]。mtDNA 拷貝數異常可引起線粒體功能障礙，進而導致神經細胞功能失調，甚至死亡，最終引起神經退行性病變[17]。部分研究發現，PD 患者的黑質神經元、腦脊液及外周血中mtDNA 拷貝數均下降，且其可能作為PD 預后的一個潛在臨床標志物[18-20]。而Stoccoro 等[10]在PD患者外周血中未發現顯著差異。我們研究發現，PD 患者外周血mtDNA 拷貝數低于對照組，與大多數研究結果一致，而與Stoccoro 等[10]的研究結果存在差異，考慮與研究對象種族、標本組織、疾病進展程度及樣本量不同有關。我們的研究顯示，外周血mtDNA 拷貝數是PD 的保護因素，且其隨著PD 患者病程進展進行性降低。推測其將來有望成為預測PD 發生和病程進展的指標。

研究表明，D 環區甲基化水平負向調控mtDNA拷貝數[13,21]。本研究表明，納入研究對象外周血D 環區第1、15 個CpG 位點(人mtDNA 序列第112、413 位核苷酸)的甲基化率與mtDNA 拷貝數呈負相關，與上述研究結果的規律一致。雖然PD 患者外周血mtDNA 拷貝數低于對照組，但PD 組與對照組間D 環區第1、15 個CpG 位點的甲基化率無統計學差異，推測由于這兩個位點甲基化水平較低(4%～ 8%)且本研究樣本量相對較少，可能存在一定實驗誤差，未來仍需要擴大樣本量驗證。且目前有關D 環區甲基化負向調控mtDNA 拷貝數的具體機制仍不明確，有待進一步研究。

綜上所述，PD 患者外周血mtDNA D 環區甲基化水平未發生顯著改變；PD 患者外周血mtDNA拷貝數低于對照組，且其隨著PD 病程的進展呈動態變化，有望成為預測PD 發生及病程進展的指標；外周血mtDNA D 環區部分CpG 位點的甲基化率與mtDNA 拷貝數呈負相關，我們推測D 環區的甲基化可能負向調控mtDNA 的復制與轉錄。本研究從外周血mtDNA D 環區甲基化水平及mtDNA 拷貝數變化的角度探討PD 的發病機制，為PD 的研究和防治提供新的方向與思路。

作者貢獻楊志甫、王麗珍：論文選題、設計，實驗指導；袁瑞：實驗檢測，數據統計，撰寫文章；趙艷青、張中奇：臨床資料采集。所有作者均已閱讀文章最終版本并同意發表。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

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