納米石墨烯醫用導電膏的制備及生物相容性評價

張藝耀，趙永岐，鄒志康，石 進，于東睿，王雪峰，陳大偉，楊 芬

1 空軍特色醫學中心神經內科，北京 100042；2 軍事科學院軍事醫學研究院，北京 100039；3 空軍軍醫大學，陜西西安 710038；4 解放軍空軍招飛局，北京 100195

神經電信號、心電信號和肌電信號均以電的形式傳遞，從電子學角度來看，是一種形似脈沖的信號，具有幅值低、持續時間短、易干擾等特點[1-4]。目前，臨床上主要應用有心電圖、肌電圖和腦電圖等。在采集過程中，體表皮膚易受到環境溫度、濕度、壓力、摩擦等變化刺激的干擾[5-7]，因此必須在表面皮膚和采集導聯電極之間建立穩定的信號采集通道。醫用導電膏作為該信號采集通道的重要媒介，可以廣泛、穩定、持續性接觸皮膚并與導聯電極之間建立連接，從而實現信號的持續采集。目前，臨床上應用的醫用導電膏主要采用的原材料為無機鹽、高分子黏稠劑和導電有機高分子材料等，其中高鹽成分對皮膚具有一定的刺激性，使用時局部皮膚易出現脫水現象，導致采集信號不穩定[8-11]。此外，還存在部分患者感覺不適、皮膚瘙癢、皮膚局部清潔較為困難或導聯電極連接易于脫落等現象。隨著納米材料的成熟和應用，納米導電材料在臨床上的應用逐漸成為材料與醫療領域應用的研究熱點，納米材料比表面積大、電信號傳遞穩定、易于構建網狀采集單元的特點可彌補目前醫療材料眾多缺陷。醫用導電膏應具備測量信號傳導穩定、抗干擾性強、阻抗低、生物兼容性良好和使用方便的優點[12]。結合納米材料特性的醫用導電膏理論上在神經電信號、心電信號和肌電信號的采集和傳遞中具備優勢。本研究探討制備納米石墨烯醫用導電膏的方法，同時表征其物理、電生理特性并評價其生物相容性，為臨床患者的電信號采集提供一種全新、安全的納米材料的導電膏。

材料與方法

1 試劑儀器 納米石墨烯(Cas.No.1034343-98-0，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；磷酸鋁凝膠(國藥準19991100，華裕(無錫) 制藥有限公司)，海藻酸鈉(Cas.No.005-38-3，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，吐溫20(Cas.No.9005-64-5，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，藥用甘油(Cas.No.56-81-5，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，對羥基苯甲酸丙酯(Cas.No.94-13-3，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，羧甲基纖維素Ⅰ(Cas.No.9004-32-4，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，磷酸鹽緩沖液[Cat.No.P3912367，世瑞納科(天津) 醫療科技有限責任公司]，胎牛血清(Cat.No.10099-141C，Gibco)，1640 培養基(Cat.No.10564-011，Gibco)，青鏈霉素雙抗(Cat.No.15 070063，Gibco)，細胞培養胰酶(Cat.No.12604021，Gibco)，IL-6 單克隆抗體(Cat.No.MAB206，R&D)，IL-6 多克隆抗體(Cat.No.AF506，R&D)，TNF-α 單克隆抗體(Cat.No.MAB610，R&D)，TNF-α 單克隆抗體(Cat.No.AF-510，R&D)，傳統醫用導電膏(Ten20? Conductive Paste，Weaver and Company)，CCK-8 檢測試劑盒(Cat.No.PA137627，Gibco)，βactin 單克隆抗體(Cat.No.MAB8929，R&D)。

超聲均質分散機(UX-600，日本三井電器)，均質分散機(FJ200，上海滬析)，研磨攪拌機(LBD-0.2，上海翎羽機電科技有限公司)，數字低值直流電阻測試儀(ETCR3640，銥泰)，電導率測試儀(SMP350，Fischer)，微量粘度計(Lovis 2000 M，安東帕)，CO2細胞培養箱(180 L，Thermo fisher)，酶標儀(270，Thermo fisher)。

2 細胞及實驗動物 HaCaT 人表皮細胞購自國家細胞資源中心。SD 大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(7 周齡，雌雄各15 只，SPF級別)。

3 納米石墨烯醫用導電膏制備 采用1 000 g 磷酸緩沖溶液(pH 6.5～ 7.5)，加入0.01 g 納米石墨烯，超聲均質分散機進行分散混勻(能量為400～500 J，持續時間25 s，間隔20 s，操作時長20～30 min)，制備成納米材料的均質混懸液；混懸液中加入50 g 丙二醇、10 g 吐溫20 和5 g 對羥基苯甲酸甲酯，用均質分散機進行分散(5 000 r/min，30 min)，形成穩定相油水混合液；油水混合液中加入60 g 磷酸鋁凝膠和100 g 海藻酸鈉，采用研磨攪拌機進行攪拌混勻(1 000 r/mim，4 h)，使磷酸鋁凝膠、海藻酸鈉與油水混合液研磨充分混勻，制備膏狀物，導電膏(150 g/瓶)，在2～ 8℃條件下冷卻2～ 3 h 定型。

4 電阻檢測 將納米石墨烯醫用導電膏和傳統醫用導電膏，分別制備成2.0 cm × 0.20 cm × 2.0 cm的薄膜，在溫度25℃，濕度40%條件下，采用數字低值直流電阻測試儀伏安法檢測兩組導電膏的電阻值，測量5 次，計算電阻均值和標準差。

5 電導率檢測 納米石墨烯醫用導電膏和傳統醫用導電膏，分別取2 g 溶于去離子水中，采用均值分散機分散(5 000 r/min，10 min)，在溫度25℃，濕度40%條件下，采用電導率測試儀檢測兩組分散液的電導率值，測量5 次，計算電導率均值和標準差。

6 黏附性檢測 納米石墨烯醫用導電膏和傳統醫用導電膏，在溫度25℃，濕度40%條件下，采用微量粘度計，按照設備使用操作說明分別檢測兩組導電膏的黏附性，測量5 次，計算黏附性均值和標準差。

7 信號穩定性檢測 采用納米石墨烯醫用導電膏和傳統醫用導電膏分別制備直徑1.0 cm，厚度0.3 cm 的圓形薄膜，在溫度25℃，濕度40%條件下，采用10 mV 電壓刺激薄膜不同部位6 個位點(圖1)，在薄膜的中心位點，采用數字低值直流電阻測試儀檢測其電壓信號，觀察電壓信號數值的變化。

8 表皮細胞培養 3.0 × 105HaCaT 人表皮細胞培養于25 cm2培養瓶中，采用1640 培養基(Cat.No.10564-011，Gibco)中加入10%的胎牛血清(Cat.No.10099-141C，Gibco)和1%青鏈霉素雙抗(Cat.No.15070063，Gibco)。培養條件：37℃、5% CO2細胞培養箱。設空白對照組、納米石墨烯醫用導電膏組(培養基中加入0.02% g/L 納米石墨烯醫用導電膏)和傳統醫用導電膏組(培養基中加入0.02% g/L傳統醫用導電膏)。

1.1 研究對象 采用目的抽樣及最大差異法選取6所院校的10名護理學全日制在讀博士研究生，其培養方式均為非定向式全日制培養，無工作經歷或入學前已與原單位解除勞動合同關系，畢業時面臨就業問題，且自愿參與本研究。訪談對象以A～J編號。選取的樣本特征能提供最大信息量或最有價值信息，代表性良好，訪談對象數量遵循信息飽和原則[7]。受訪者年齡24～35歲，平均(27.40±3.47)歲，見表1。

9 CCK-8 實驗檢測細胞增殖 5.0 × 103HaCaT 人表皮細胞200 μL 接種于96 孔板，各組分別重復5 個復孔；在24 h、48 h、72 h、96 h 和120 h 加入CCK-8 溶液20 μL 孵育4 h，在酶標儀上450 nm波長檢測其OD 數值，計算其均值和標準差，繪制其生長曲線。

10 Western blot 檢測炎癥因子表達水平 各組細胞均處理48 h 后，收集細胞，經磷酸鹽緩沖液3 次清洗后，采用RIPA 細胞裂解液在0℃對細胞進行裂解10 min，采用低溫離心機以16 000 g離心15 min，取上清液加入Loading buffer 和蛋白酶抑制劑Cocktail，95℃蛋白變性5 min，采用10%聚丙烯酰胺膠對蛋白進行分離電泳。電泳條件：電壓100 V，時間90 min；采用0.22 μm 的PVDF 膜進行轉膜，濕法轉膜條件：溫度2～8℃，電壓100 V，時間12 h，IL-6 和TNF-α 抗體2～ 8℃孵育過夜，二抗室溫條件孵育2 h，采用ECL 發光試劑盒進行顯影。

11 導電膏動物實驗30 只SD大鼠隨機分為3 組，SD 大鼠脊背部剔除皮膚毛發后，空白對照組不做處理；納米石墨烯醫用導電膏組涂抹直徑0.6 cm 的納米石墨烯醫用導電膏，厚度約0.20 cm；傳統醫用導電膏組涂抹直徑0.6 cm 的導電膏，厚度約0.20 cm。實驗時間共10 d，觀察各組動物皮膚的變化，如顏色、脫水情況、導電膏脫落情況。實驗10 d 后處死大鼠，取皮膚表皮組織定理分析后進行炎癥因子的蛋白表達分析。

12 統計學方法采用SPSS 16.0進行統計分析，數據以表示，兩組間比較采用t檢驗分析；多組間比較采用單因素方差分析(兩兩比較采用LSD-t)；P＜0.05 為差異有統計學意義。

結果

1 電學和物理性能指標 納米石墨烯醫用導電膏表現出優異的低阻抗性、導電性和信號穩定性，它和傳統醫用導電膏的電阻數值分別為(1.22 ±0.13) Ω 和(4.53 ± 0.51) Ω，電導率數值分別為(5.53 ± 0.027) μs/cm 和(1.48 ± 0.124) μs/cm，電壓數值分別為(9.73 ± 0.027) mV 和(8.32 ± 0.12) mV，差異均有統計學意義(P＜0.05)。它和傳統醫用導電膏的黏附性數值分別為(13 300 ± 430) mPa·s 和(12 230 ± 324) mPa·s，差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 納米石墨烯醫用導電膏和傳統醫用導電膏的電學和物理指標比較Tab.1 Comparison of electrical and physical properties between nano graphene medical conductive paste and commercially available conductive paste

2 表皮細胞生長曲線比較 CCK-8 實驗顯示，在24 h、48 h、72 h、96 h 和120 h 各時間點，納米石墨烯醫用導電膏組與空白對照組細胞增殖的OD 數值無統計學差異(P＞0.05)，由此可見納米石墨烯醫用導電膏對細胞增殖無影響；而在96 h和120 h，傳統醫用導電膏組細胞增殖低于空白對照組(P＜0.01)，提示傳統醫用導電膏具有抑制細胞增殖的作用。見圖2。

圖2 表皮細胞增殖曲線比較(aP＜0.01，vs 納米石墨烯醫用導電膏組和空白對照組)Fig.2 Comparison of epidermal cell proliferation between the three groups (aP＜0.01,vs nano graphene medical conductive paste group and control group)

圖3 表皮細胞的Western blot 蛋白分析Fig.3 Western blot protein analysis results of human epidermal cells

4 大鼠皮膚及表皮組織的炎性表達比較 納米石墨烯醫用導電膏組的皮膚顏色無變化、無脫水現象發生、無脫落現象；傳統醫用導電膏組的皮膚顏色微紅、無脫水現象發生、無脫落現象；空白對照組皮膚無變化。動物表皮組織Western blot 檢測結果顯示，納米石墨烯醫用導電膏組、傳統醫用導電膏組和空白對照，各組間IL-6 表達無統計學差異(P＞0.05)。而傳統醫用導電膏組的TNF-α蛋白表達升高(P＜0.05)，由此說明傳統醫用導電膏可引起炎性反應。見圖4。

圖4 大鼠表皮組織的Western blot 蛋白分析結果Fig.4 Western blot protein analysis results of rat epidermis

討論

醫用導電膏是臨床上心電信號、腦電信號和肌電信號采集的重要媒介和必備品。目前，傳統醫用導電膏采用的原料普遍為高含量無機鹽、高分子黏稠劑和導電有機高分子材料，生物相容性不佳，對患者的皮膚具有一定的刺激性，使用時局部皮膚易出現脫水現象，導致信號不穩定[6,13-14]。此外，還存在部分患者使用感覺不適或出現皮膚瘙癢現象。同時，皮膚局部清潔較為困難或易出現導聯電極連接脫落等缺點[15]。

納米石墨烯材料在醫用導電膏方面的應用研究屬于領域的空白。本研究成功制備了新型納米石墨烯醫用導電膏(屬于原創性研發，并獲得國家發明專利授權(專利號：202211009455.0)；由生理濃度磷酸鹽緩沖液、二維納米石墨烯材料、表面活性劑材料、保濕劑、黏稠劑和消毒組分組成。主要組分原理分析：(1)緩沖溶液為生理濃度磷酸鹽溶液，符合表皮組織的生理滲透壓要求不容易造成皮膚的高滲脫水；(2)導電材料為納米石墨烯材料，具有比表面積大、導電性良好、電阻率低的特點，在膏狀物體中易于形成網狀交通結構，進而加速信號的轉導[13]等特性；(3)表面活性劑采用與皮膚高親和力的吐溫20 材料，該材料易于與皮膚之間建立良好的信號通道的作用[16]；(4)保濕劑為丙二醇，丙二醇在該導電膏中具有保濕功效，避免局部皮膚水分的脫失；(5)黏稠劑為海藻酸鈉和水性磷酸鋁凝膠，使得該醫用導電膏的特性具備高黏附特性和水性基材易清除的特點[17]。

該納米石墨烯醫用導電膏的電學特性實驗結果顯示，與傳統醫用導電膏對比，納米石墨烯導電膏的電阻值低、電導率高。由此可以判定該納米石墨烯導電膏滿足阻抗低的要求[18]。信號穩定性檢測結果顯示，納米石墨烯醫用導電膏的電信號穩定性遠超傳統醫用導電膏，其中傳統醫用導電膏組的電壓信號存在衰減，因此判定該納米石墨烯醫用導電膏的電信號傳導穩定。納米石墨烯醫用導電膏由于測量信號傳導穩定、抗干擾性強和阻抗低的特性具有良好的臨床應用前景。黏附性實驗測試和動物實驗結果顯示，納米石墨烯醫用導電膏與傳統醫用導電膏的黏附性無顯著差異。

生物相容性方面，表皮細胞CCK-8 細胞增殖實驗顯示，在120 h 內納米石墨烯醫用導電膏組與空白對照組的細胞增殖無顯著差異，由此證明該納米石墨烯醫用導電膏不具有細胞毒性；而傳統醫用導電膏組在96 h 后細胞增殖受到影響，具有細胞毒性；表皮細胞和大鼠表皮組織的Western blot 分析顯示，與空白對照組比較，納米石墨烯醫用導電膏組的IL-6 和TNF-α 炎性指標未見升高，而傳統醫用導電膏組引起細胞IL-6 表達升高和動物表皮組織中TNF-α 表達升高[19]。由此可見在傳統醫用導電膏組引起了炎性表達。動物的皮膚發紅現象再次印證了炎性指標表達升高的結果，而納米石墨烯醫用導電膏并未引起局部皮膚或細胞的炎性反應。傳統醫用導電膏細胞與組織炎性因子的不一致，需要后續實驗研究進一步探討其機制，但并不影響本實驗判斷其炎性反應發生結果；動物實驗結果顯示，傳統導電膏組大鼠皮膚出現輕微皮膚發紅現象，而納米石墨烯醫用導電膏組未出現此現象，證明納米石墨烯醫用導電膏黏附性和使用性良好。

綜上所述，納米石墨烯醫用導電膏制備方法簡單，測量信號傳導穩定，抗干擾性強，阻抗低，生物兼容性好，能夠滿足臨床使用的要求，具有良好的臨床應用前景。

作者貢獻張藝耀：論文選題，數據收集，統計學分析，論文撰寫，論文修改；趙永岐：論文選題，論文修改；鄒志康：論文指導，論文修改；石進：論文選題，論文修改；于東睿：數據收集，統計學分析；王雪峰：數據收集，統計學分析；陳大偉：論文修改；楊芬：論文選題，論文指導，論文修改。

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