耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌對喹諾酮類藥物的耐藥特性及機制研究

宋曼雅，劉長鑫，張 侃，馬 林，王 博，郭 樺，丁俊諭，趙慧珺，周治同，管希周

1解放軍醫學院，北京 100853；2 解放軍總醫院第八醫學中心呼吸與危重癥醫學部，北京 100091

肺炎克雷伯菌是醫院常見病原體，可引起血流、泌尿道、肺部等多個部位的感染，其中耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP) 的出現給全球的公共衛生帶來嚴重威脅。產碳青霉烯酶是CRKP對碳青霉烯類藥物耐藥的最重要機制，主要包括肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemases，KPC)、新德里金屬-β-內酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase，NDM)、苯唑西林酶(oxacillinase 48 type enzyme，OXA-48)[1-2]。產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌通常攜帶對多種抗菌藥物的耐藥基因(喹諾酮類、氨基糖苷類、β-內酰胺類)，從而對多種類型的抗菌藥物產生耐藥性[3]。喹諾酮類藥物具有廣譜抗菌活性，在臨床上應用比較廣泛，也用于治療對碳青霉烯類不敏感的肺炎克雷伯菌感染，由于其廣泛應用，耐藥性不斷增加[4]。環丙沙星為第三代喹諾酮類藥物，在臨床上應用近30 年后，WHO 將其評價為最佳抗生素之一[5]。莫西沙星和西他沙星為第四代的喹諾酮類藥物，莫西沙星為呼吸喹諾酮類藥物，其在肺組織中藥物濃度較高，對部分病原體抗菌活性更強。西他沙星2019 年于我國上市，對其他喹諾酮類藥物耐藥的菌株仍具有相對較高的活性[6-7]。喹諾酮類藥物是合成抗菌藥物，作用機制主要是抑制細菌的DNA 促旋酶和拓撲異構酶Ⅳ[8]。喹諾酮的耐藥機制包括喹諾酮耐藥決定區(quinolone resistance determining region，QRDR) 的突變，獲得質粒介導的喹諾酮耐藥(plasmid mediated quinolone resistance，PMQR)基因，以及外排泵的過表達等[5]。全基因組測序(whole gene seqencing，WGS)對于了解病原體的耐藥特點，流行特征等具有顯著優勢[9]。本實驗通過藥敏試驗研究CRKP 對喹諾酮類藥物的耐藥特性，通過PCR 及全基因組測序研究CRKP 對喹諾酮類藥物的耐藥機制，探明其分子病原學特征，為治療該菌導致的感染提供實驗依據。

材料與方法

1 菌株來源 收集解放軍總醫院2015 -2018 年臨床分離CRKP 29 株，無同一患者分離的重復菌株，標本來源均為血液。其中blaKPC陽性CRKP菌株21 株，blaOXA-48陽性CRKP 菌株5 株，blaNDM陽性CRKP 菌株3 株，菌株均經VITEK 系統進行鑒定，至少對碳青霉烯類藥物中的一種耐藥。本研究經解放軍總醫院倫理委員會批準，批件號：S2021-689-01。

2 主要儀器及試劑 包括梅里埃VITEK MS 全自動快速微生物質譜檢測儀，梅里埃VITEK 2 Compact 全自動藥敏分析儀，NanoDrop2000 超微量分光光度計，美國伯樂BIO-RAD 公司熒光定量PCR 儀；西他沙星購自美國GLPGIO 公司，莫西沙星、環丙沙星、替加環素、黏菌素購自美國Med ChemExpress 公司，依拉環素購自上海麥克林生化科技有限公司，外排泵抑制劑1-(1-萘甲基)哌嗪(NMP) 購自上海畢得醫藥科技股份有限公司。美國因美納公司HiSeqTM、TruSeqTMDNA Sample Prep Kit。

3 細菌鑒定及藥敏試驗 采用梅里埃VITEK MS質譜儀和梅里埃VITEK 2 Compact 全自動藥敏分析儀分別進行菌株鑒定及常規藥敏測定。用微量肉湯稀釋法分別測定西他沙星、環丙沙星、莫西沙星對CRKP 的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentratio，MIC)值。莫西沙星、環丙沙星的折點根據CLSI M100(第20 版)描述的標準對藥敏結果進行判定[10]；西他沙星的折點參照文獻中的標準。MIC≤1 μg/mL 為敏感，MIC≥4 μg/mL 為耐藥[11]；藥敏試驗的質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。

4 聯合藥敏試驗 根據棋盤法設計原理和微量肉湯稀釋法操作要求進行聯合藥敏試驗，西他沙星的參考折點同前，黏菌素根據CLSI M100(第20 版)描述的標準對藥敏結果進行判定[10]。替加環素參考歐洲抗微生物藥敏試驗委員會(EUCAST) 推薦標準對藥敏結果進行判讀，替加環素MIC≤2 μg/mL為敏感，MIC≥8 μg/mL 為耐藥[12]。依拉環素尚無藥敏折點判定標準，參照替加環素判斷標準進行判定。聯合抑菌指數(fractional inhibitory concentration index，FIC) 計算：FIC=聯合后甲藥MIC/聯合前甲藥MIC+聯合后乙藥 MIC/聯合前乙藥MIC。FIC≤0.5 為兩藥存在協同作用，0.5＜FIC＜1為兩藥存在部分協同作用，1 為兩藥存在相加作用，l＜FIC≤4 為兩藥無相關作用，FIC＞4 為兩藥有拮抗作用。對于出現協同或相加的聯合藥敏試驗結果，均重復2 次試驗，取2 次相同的結果[13]。

5 外排泵抑制劑對西他沙星MIC 值影響分析采用微量肉湯稀釋法，在西他沙星中添加固定濃度的外排泵抑制劑NMP(1-甲基-2 吡咯烷酮)，使西他沙星的最終濃度為0.062 5～ 128 mg/L，NMP的最終濃度為75 mg/L，比較添加NMP 后對西他沙星MIC 值的影響。

6 QRDR 突變的鑒定 根據細菌DNA 提取試劑盒的說明書提取細菌DNA，引物(表1)根據參考文獻[14]進行設計，運用熒光定量PCR 儀擴增目的基因gyrA 和parC。將檢測為陽性的DNA 擴增產物送至上海生物工程有限公司進行Sanger 測序，測序結果通過BLAST 在美國國家生物技術信息中心數據庫中(national center for biotechnology information，NCBI)進行比對分析。

表1 GyrA 和ParC 基因的引物序列及產物大小Tab.1 Primer sequences and product sizes for GyrA and ParC genes

7 全基因組測序菌株DNA 提取、測序、組裝 根據說明書使用NEBNext?UltraTMD-NA Library Prep Kit 提取試劑盒提取菌株DNA，提取出的DNA 在Nanodrop2000 超微量分光光度計上檢測濃度，用Quantus Fluorometer 檢測試劑盒對DNA 的濃度進行定量。提取的DNA 在illumina HisSeqTM平臺上進行測序，總測序讀長為300 bp。構建文庫采用TruSeqTMDNA Sample Prep Kit，根據說明書進行操作。通過Abricate V1.0.1 檢測，將全基因組測序結果提交至CARD、Resfinder 等數據庫進行耐藥基因、MLST 分型、外排泵基因的注釋分析。

8 統計學分析 采用SPSS 26.0 統計學軟件對數據進行分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

結果

1 CRKP 耐藥率29株CRKP菌株對西他沙星、莫西沙星、環丙沙星的耐藥率分別為90%、93%、93%，西他沙星MIC50值是莫西沙星的4 倍，環丙沙星的8 倍，西他沙星MIC90值是莫西沙星的2 倍，環丙沙星的4 倍，見表2。西他沙星對blaKPC、blaNDM、blaOXA-48陽性的CRKP 的敏感度分別為4.7%、66.6%、0；耐藥率分別為95.3%、33.4%、100%；莫西沙星、環丙沙星對blaKPC、blaNDM、blaOXA-48陽性的CRKP 的敏感度分別為0、66.6%、0，耐藥率分別為100%、33.4%、100%，見表3。

表2 CRKP 對喹諾酮類藥物的耐藥率和敏感度Tab.2 Susceptibility of CRKP to antimicrobial agents

表3 不同基因型CRKP 對喹諾酮類藥物的耐藥率和敏感度Tab.3 The resistance and susceptibility rates of different CRKP genotypes to quinolones

2 西他沙星聯合黏菌素、替加環素、依拉環素對CRKP 的體外活性 西他沙星聯合黏菌素協同率為10%，部分協同率為17%，相加作用為17%，無關作用為30%，未發現拮抗作用。西他沙星的MIC50值為單藥時的4 倍，MIC90為單藥時的2 倍，黏菌素MIC50值為單藥時的2 倍。西他沙星聯合替加環素部分協同率為3%，相加作用為3%，無關作用為87%。西他沙星聯合依拉環素協同率為3%，部分協同率為14%，相加作用為3%，無關作用為80%，未發現拮抗作用。依拉環素MIC50值為單藥時的6.7 倍，MIC90與單藥應用時的相同。見表4。

表4 西他沙星聯合其他藥物對CRKP 的體外抗菌活性Tab.4 In vitro antimicrobial activity of sitafloxacin in combination with other antimicrobial agents against CRKP

3 29株CRKP 中QRDR 突變率blaKPC、blaNDM、blaOXA-48陽性菌株突變率分別為95%、0、100%。blaKPC陽性的CRKP 菌株21 株中20 株(95%)存在GyrA突變，其中19株為(Ser83→Ile)和(Asp87→Gly)突變，1 株為(Ser83→Phe)和(Asp87→Ala)突變，8 株(38%) 為ParC(Ser83→Ile) 突變，1 株未發現任何突變。blaOXA-48陽性的CRKP 菌株5 株(100%)均存在突變(Ser83→Phe)和(Asp87→Asn)，3 株(60%) 存在ParC(Ser83→Ile) 突變。blaNDM陽性的CRKP 菌株3 株均未發現突變。29 株CRKP總共有86% CRKP 菌株在gyrA 中存在至少2 個以及parC 中的第3 個突變。3 種不同基因型CRKP菌株gyrA 亞基氨基酸的取代類型存在一定差異，比較不同氨基酸取代的菌株之間MIC 值差異，均無統計學意義(P＞0.05)。見表5。

表5 不同基因型CRKP 中QRDR 突變情況Tab.5 QRDR mutations in different CRKP genotypes

4 質粒介導的喹諾酮耐藥基因攜帶情況 29 株CRKP 中21 株blaKPC-2陽性，1 個菌株blaNDM-5陽性，2 個菌株blaNDM-1陽性，5 個菌株blaOXA-48陽性。PMQR 基因的攜帶情況：29 株CRKP 菌株中有24 株發現攜帶PMQR 基因，總檢出率為83%，共攜帶4 種PMQR 基因，分別為qnrB4、qnrB17、oqxAB、aac(6’)-lb-cr，qnrB4 的檢出率為10.3%，qnrB17 檢出率為6.8%，oqxAB 檢出率為79.3%，aac(6’)-lb-cr 檢出率為3.4%；gyrA 和parC 的QRDR突變和PMQR 基因共存率為69.0%。見表6。

表6 PMQR 基因的陽性率Tab.6 Prevalence of PMQR gene carriage

5 外排泵的攜帶情況 在這些菌株中檢測到多種類型的外排泵基因：外排泵家族類型包括RND(耐藥結瘤和細胞分裂)家族外排泵、MFS(主要促進者超家族)、MATE(多藥和毒性化合物擠出)、ABC(ATP 結合盒) 超家族；其中RND 家族外排泵AcrAB-TolC 在所有菌株中均檢測到，oqxAB的檢出率為79.3%。外排泵抑制劑使西他沙星對CRKP 的敏感度由10% 上升至83%，耐藥率由90%降至7%。見表7。

表7 RND 家族外排泵陽性率Tab.7 Positive rate of RND family efflux pumps

6 多位點序列分型29株菌株共檢測到8 種ST 分型，其中blaKPC陽性菌株有4 種類型，分別為ST11、ST15、ST86、ST2237，ST11 型占比最大，85.7%的blaKPC陽性菌株屬于ST11 型；5 株blaoxa-48陽性菌株均屬于ST383 型；3 株blaNDM陽性菌株分別為ST23、ST55、ST65 型。見表8。

表8 不同基因型CRKP 的ST 分型Tab.8 ST typing of CRKP of different genotypes

討論

產KPC 酶、NDM 酶、OXA-48 酶CRKP 在全世界流行，給全球公共衛生帶來巨大挑戰[15]。喹諾酮類藥物抗菌譜廣，對革蘭陽性或陰性細菌均有活性，是目前應用最廣泛的藥物之一[16]。肺炎克雷伯菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥性及耐藥機制的模式在不同的國家存在一定差異[4]。在本研究中，解放軍總醫院CRKP 對喹諾酮類藥物的耐藥率均在90%以上，CRKP 對新一代的喹諾酮類藥物西他沙星的耐藥率與莫西沙星、環丙沙星差異不大，考慮不同喹諾酮藥物之間存在交叉耐藥性。但西他沙星對CRKP 的活性強于莫西沙星及環丙沙星。產NDM 酶CRKP 對喹諾酮類藥物敏感性較好，但本研究中產NDM 酶CRKP 數量較少，還需擴大樣本量來進一步驗證。聯合藥敏試驗結果顯示，西他沙星聯合黏菌素、依拉環素、替加環素對CRKP 均有協同或部分協同等抗菌作用。其中以與黏菌素的聯合作用最為顯著。呈現協同部分協同或相加作用的菌株為70%，呈無關作用的菌株僅為30%。兩藥聯用時，西他沙星與黏菌素的活性均較前提高。西他沙星的logP 值表明西他沙星是疏水性藥物，黏菌素對細胞膜的完整性的破壞增強了疏水劑的敏感性可能是黏菌素增強西他沙星敏感性的作用機制[17]。

通過進一步研究CRKP 對喹諾酮類藥物的耐藥機制，我們發現86.2% 的菌株QRDR 存在突變，這比Zeng 等[18]的研究中5% 的CRKP 突變率要高，與Zhan 等[4]的研究中78.5% 的CRKP突變率相近。而本研究中對不同基因型的CRKP突變率做了統計，發現blaKPC-2、blaOXA-48陽性的菌株QRDR 突變率較高，而blaNDM陽性的菌株QRDR 區均未發現突變。這可能是blaNDM陽性的菌株對喹諾酮類藥物敏感性較好的主要原因。但本研究中blaNDM陽性菌株的數量較少，還需擴大樣本量做進一步的驗證。突變的菌株累積突變位點均為2 個及以上，至少在gyrA 亞基上存在83位和87 位的兩個突變，伴或不伴parC 亞基80 位的突變。不同基因型的CRKP 的QRDR 突變類型存在差異，考慮為同一基因型的菌株之間通過克隆擴增進行了垂直傳播導致的。比較兩者對喹諾酮類藥物耐藥性的區別，未發現顯著差異。QRDR存在突變的菌株對于環丙沙星、莫西沙星介導的大多為高水平的耐藥(MIC≥16 mg/L)，對西他沙星介導的大多是中等水平的耐藥(MIC≤8 mg/L)，可見西他沙星對QRDR 突變菌株的抑制能力要強于環丙沙星、莫西沙星，未存在突變的菌株對喹諾酮類藥物敏感性較好，可見QRDR 突變是CRKP 對喹諾酮類藥物主要耐藥機制之一。

PMQR 質粒介導的耐藥基因被認為賦予了菌株對喹諾酮類藥物低水平的耐藥[19]。本研究中主要檢出4 種PMQR 基因，qnrB4、qnrB17、oqxAB、aac(6’)-lb-cr，其中外排泵基因oqxAB 的攜帶率最高，是PMQR 中主要的耐藥基因。病原體多藥耐藥性和外排泵的過表達具有重要相關性。造成多藥耐藥性的RND 家族外排泵是最具特征性的，其過表達是革蘭陰性菌產生多藥耐藥的主要原因之一[20]。全基因組測序結果表明，解放軍總醫院CRKP 菌株廣泛攜帶RND 家族外排泵AcrAB-TolC 及oqxAB。添加外排泵抑制劑后，西他沙星對CRKP 的敏感度由10%升至83%，耐藥率由90%降至7%。可見外排泵的過表達是CRKP對喹諾酮類藥物重要耐藥機制。

29 株肺炎克雷伯菌分別屬于8 種不同ST 分型。85.7%的blaKPC陽性菌株屬于ST11 型，ST11型CRKP 菌株是解放軍總醫院優勢傳播耐藥菌株。

綜上所述，本研究發現解放軍總醫院blaKPC-2、blaOXA-48陽性CRKP 的QRDR 突變率較高，blaNDM陽性CRKP 的QRDR 未發現突變，外排泵抑制劑可大大降低CRKP 對喹諾酮類藥物的耐藥性，QRDR 的突變及外排泵的過表達是CRKP 對喹諾酮類藥物的主要耐藥機制。解放軍總醫院的優勢克隆菌株為ST11 型CRKP。本研究存在的局限性為blaOXA-48、blaNDM陽性CRKP 菌株數量較少，可能無法反映該類菌株的特點。

作者貢獻宋曼雅：總體構思，調查研究，撰寫初稿；劉長鑫、張侃、馬琳：方法設計，監督指導；王博、郭樺、丁俊諭：審讀；趙慧珺、周治同：項目管理；管希周：總體構思，監督指導，審讀和修訂。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

數據共享聲明本論文相關數據可依據合理理由從作者處獲取，Email：17865650806@163.com。