55 型人腺病毒致hDSG2 轉(zhuǎn)基因小鼠肺感染動(dòng)物模型的建立及意義

周恩祿，孫軍平，張明月，韓欣潔，王浚宇，汪建新,

1解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)部，北京 100091

人腺病毒(human adenovirus，HAdV) 是一種沒有包膜的雙鏈DNA 病毒，已報(bào)道110 余種基因型，可以分為A～ G 7 組[1]。HAdV 具有組織嗜性，7 型、11 型、14 型和55 型等B 組腺病毒主要引起呼吸道感染，在我國(guó)常于冬春季交際時(shí)節(jié)暴發(fā)流行[2]。其中，55 型人腺病毒(HAdV-B55)感染力、致病力較強(qiáng)，尤其是在軍隊(duì)和學(xué)校曾多次暴發(fā)流行[3-5]。50%以上感染的患者可發(fā)展成病毒性肺炎，若不及時(shí)治療可發(fā)展至危重癥肺炎危及生命[6-7]。在探究HAdV 感染發(fā)病機(jī)制、藥物治療以及多價(jià)疫苗研制等研究過程中，嚙齒類小動(dòng)物模型的作用不可或缺[8]。目前已知，HAdV 感染進(jìn)入宿主細(xì)胞的主要途徑是通過與細(xì)胞膜表面的受體結(jié)合后誘導(dǎo)胞飲作用。因此，不同宿主間細(xì)胞表面受體的不同是HAdV 具有種屬特異性的主要原因。已有研究表明細(xì)胞膜表面的橋粒芯糖蛋白2 是HAdV-B55 進(jìn)入細(xì)胞的主要受體[9-11]。而小鼠與人的橋粒芯糖蛋白2 種屬差異較大，HAdVB55 無法進(jìn)入野生型小鼠肺組織細(xì)胞，不能完整復(fù)制出HAdV-B55 感染人肺組織的病理生理過程。隨著CRISPR-Cas9 技術(shù)的應(yīng)用發(fā)展，用人源化轉(zhuǎn)基因小鼠感染動(dòng)物模型進(jìn)行研究能夠有效地解決這一問題[12-14]。因此本實(shí)驗(yàn)采用人源化受體橋粒芯糖蛋白2(humanized receptor desmoglein-2，hDSG2)轉(zhuǎn)基因小鼠復(fù)制HAdV-B55 肺感染動(dòng)物模型，以進(jìn)一步研究HAdV-B55 致病機(jī)制和防治措施。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 6～ 8 周齡、體質(zhì)量(20 ± 2) g的雄性hDSG2 轉(zhuǎn)基因小鼠[北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0002] 和相同周齡、體質(zhì)量的雄性SPF 級(jí)野生型C57BL/6N(C57)小鼠各25 只[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001]。按體質(zhì)量隨機(jī)數(shù)隨機(jī)將hDSG2 轉(zhuǎn)基因小鼠組(hD 組)和C57 小鼠組(C57 組)各分為感染后3 d、5 d、7 d、14 d 組和PBS 對(duì)照組(C 組) 5 個(gè)亞組，每組5 只。在中國(guó)疾病預(yù)防控制中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心ABSL-2 負(fù)壓屏障系統(tǒng)中分籠飼養(yǎng)，使用高溫高壓滅菌后的飼料和飲水飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。在實(shí)驗(yàn)開始前所有動(dòng)物在安靜條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，自由食水。本實(shí)驗(yàn)已通過中國(guó)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查(批準(zhǔn)文號(hào)：2018-CCDCWER-009)。

2 主要試劑及儀器 (1)病毒株：解放軍疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室保存的HAdV-B55 病毒株(編號(hào)S1291809019)。通過HAdV-B55 感染A549 細(xì)胞的方法[11]，傳代、分離、純化取得復(fù)制不超過3 代的HAdV-B55 濃縮液(108TCID50)。(2) 主要試劑：戊巴比妥鈉(實(shí)驗(yàn)室保存)，PBS 緩沖液(Gibco)，組織DNA 提取試劑盒(天根生化)，組織RNA 提取試劑盒(天根生化)，超敏多因子試劑盒(Meso Scale Discovery，MSD)。(3) 主要儀器：BS48 生物安全工作臺(tái)(Tecniplast)，熒光定量PCR 儀(Bio-rad)，超敏多因子電化學(xué)發(fā)光分析儀(MSD)，全景切片掃描儀[3DHISTECH(Hungary)]。

3 病毒感染方法 采用2%戊巴比妥鈉40 μL/10 g腹腔注射麻醉，麻醉后hDSG2 轉(zhuǎn)基因小鼠組和C57 小鼠組的感染實(shí)驗(yàn)亞組用HAdV-B55 液(108TCID50)滴鼻感染，50 μL/只。對(duì)照組用相同劑量的PBS 緩沖液滴鼻，以上操作均在當(dāng)日同條件下完成。

4 小鼠一般狀況及體質(zhì)量觀察 每日觀察小鼠活動(dòng)情況。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉滴鼻前，對(duì)小鼠進(jìn)行稱重并記錄為原始體質(zhì)量；自滴鼻感染后1 d 開始至14 d，每日同一時(shí)間對(duì)所有小鼠進(jìn)行稱重并記錄為當(dāng)日體質(zhì)量。體質(zhì)量變化(%)計(jì)算公式：體質(zhì)量變化(%)=[(當(dāng)日體質(zhì)量-原始體質(zhì)量)/原始體質(zhì)量] × 100%。

5 肺系數(shù)測(cè)定和肺組織病理觀察 取小鼠雙肺組織，去除血管、氣管等多余組織，濾紙吸干表面水分，用電子天平稱雙肺濕重，計(jì)算肺系數(shù)(%)[肺系數(shù)=肺濕重(g)/小鼠體質(zhì)量(kg) × 100%]。左肺組織4%多聚甲醛固定，HE 染色光鏡下觀察肺組織病理變化。

6 HAdV-B55 基因拷貝量實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè) 取右肺組織10 mg，經(jīng)低溫組織研磨勻漿后，提取DNA，實(shí)時(shí)熒光定量法(qPCR)檢測(cè)肺組織HAdVB55 基因拷貝量(2-ΔΔCt法)。內(nèi)參使用GAPDH。

7 hDSG2 基因及炎癥因子mRNA 表達(dá)實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè) 取右肺組織10 mg，經(jīng)低溫組織研磨勻漿后，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量法(RTqPCR)檢測(cè)肺組織內(nèi)hDSG2 基因、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、γ 干擾素(interferon-γ，IFN-γ)mRNA 表達(dá)量(2-ΔΔCt法)。內(nèi)參使用GAPDH。

8 血清中炎癥因子水平檢測(cè) 腹腔注射麻醉下，采用心臟釆血法取小鼠全血，室溫靜置20 min，3 000 r/min 離心10 min，分離血清。采用MSD 超敏多因子電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法檢測(cè)小鼠血清中炎癥因子水平。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和圖片繪制均采用Graphpad Prism 8.0 (GraphPad Software Inc.)軟件，計(jì)量資料以表示，兩獨(dú)立樣本間比較采用t檢驗(yàn)，多組樣本采用單因素方差分析或雙因素方差分析，重復(fù)觀測(cè)資料使用重復(fù)測(cè)量的雙因素方差分析，組間比較兩兩t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 小鼠感染后一般狀況和體質(zhì)量變化 滴鼻感染HAdV-B55 后第1 天開始，感染小鼠均表現(xiàn)出活動(dòng)減少，在籠內(nèi)抱團(tuán)蜷縮，個(gè)別小鼠毛發(fā)凌亂、倒立，對(duì)照組小鼠精神較感染組活躍，毛發(fā)順滑有光澤；自第3 天開始，hD 組感染小鼠較C57 組活躍度差，反應(yīng)相對(duì)遲鈍。hD 組小鼠感染后1 d 體質(zhì)量降低較顯著，體質(zhì)量增長(zhǎng)慢(P＜0.01)。見圖1。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化(aP＜0.01)Fig.1 Changes in mice weight in each group (aP＜0.01)

2 肺系數(shù) hDSG2 轉(zhuǎn)基因小鼠組和C57 小鼠組感染病毒后3 d、5 d、7 d 和14 d 的肺系數(shù)均比各自PBS 對(duì)照組高；感染后14 d hDSG2 轉(zhuǎn)基因小鼠組的肺系數(shù)顯著高于C57 小鼠組(P＜0.05)，提示感染病毒后14 d hDSG2 轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織內(nèi)水腫、滲出等病理變化較C57 小鼠重。見圖2。

圖2 兩組小鼠肺系數(shù)比較Fig.2 Comparison of lung coefficient between the two groups

3 肺組織病理變化 感染HAdV-B55 后小鼠肺組織可見肺泡壁增厚、肺間質(zhì)水腫、支氣管肺泡擴(kuò)張、腔內(nèi)嗜酸性滲出物、小支氣管及血管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等炎癥表現(xiàn)[15]；hD-14 d 組較C57-14 d 組炎癥表現(xiàn)重。對(duì)照組小鼠肺組織未見明顯炎癥表現(xiàn)。見圖3。

圖3 肺組織病理變化(20×)A：hD-14 d 組，可見大面積肺泡壁重度增厚，伴大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(黑色箭頭)；可見支氣管上皮細(xì)胞排列不規(guī)則，腔內(nèi)可見嗜酸性物質(zhì)、壞死脫落的上皮細(xì)胞(藍(lán)色箭頭)；血管周圍可見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(綠色箭頭)。B：C57-14 d 組，可見肺泡壁輕度增厚，伴少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(黑色箭頭)；少量支氣管上皮細(xì)胞 排列不規(guī)則，腔內(nèi)可見嗜酸性物質(zhì)(藍(lán)色箭頭)。C：hD 對(duì)照組，正常肺組織病理表現(xiàn)。D：C57 對(duì)照組，正常肺組織病理表現(xiàn)Fig.3 Pathological changes in lung tissue (20×)A: hDSG2-14 d group,extensive severe thickening of alveolar wall with massive inflammatory cell infiltration (black arrow)was observed,and irregular arrangement of bronchial epithelial cells could be seen,with eosinophilic matters as well as necrotic and exfoliated epithelial cells in the cavity (blue arrow);lymphocyte infiltration surrounding blood vessels(green arrow) was observed.B: C57-14 d group,mild thickening of alveolar wall with slight inflammatory cell infiltration (black arrow) was observed;irregular arrangement of a small amount of bronchial epithelial cells,with eosinophilic matters could be seen in the cavity (blue arrow);lymphocyte infiltrations surrounding blood vessels (green arrow) was observed.C: hDSG2 control group,pathological of normal lung tissue.D: C57 control group,pathological of normal lung tissue

4 肺組織內(nèi)hDSG2 mRNA 表達(dá)水平和HAdVB55 基因拷貝量 RT-qPCR 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織內(nèi)hDSG2 mRNA 表達(dá)水平基本一致，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖4)。C57 小鼠RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示CT 值大于35 或無數(shù)值，根據(jù)判讀標(biāo)準(zhǔn)判定為陰性，可以認(rèn)定C57 小鼠肺組織內(nèi)不存在hDSG2 基因片段。qPCR 結(jié)果顯示，hD 組在感染HAdV-B55 后7 d、14 d 病毒基因拷貝量顯著高于C57 組(P＜0.05)。見圖5。

圖4 hD 組小鼠肺組織內(nèi) hDSG2 mRNA 表達(dá)水平Fig.4 mRNA expression of hDSG2 in lung tissues of mice in hD group

圖5 兩組小鼠肺組織內(nèi) HAdV-B55 基因拷貝量Fig.5 Copy number of HAdV-B55 gene in lung tissue in two groups

5 感染后不同時(shí)間點(diǎn)肺組織內(nèi)IL-6、IFN-γ mRNA表達(dá)水平比較 hD 組在HAdV-B55 滴鼻感染后，肺組織內(nèi)的IL-6 mRNA 表達(dá)存在顯著變化(P＜0.01)，呈現(xiàn)先逐步升高后下降的趨勢(shì)；其中hD-3 d、5 d、7 d 組較hD-C 組表達(dá)水平顯著上調(diào)(P＜0.05，vshD-3 d、hD-5d 組；P＜0.01，vshD-7 d 組)，并且均高于hD-14 d 組(P＜0.01)，hD-14 d 組較hD-C 組表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)。C57 小鼠滴鼻感染病毒后肺組織內(nèi)IL-6 mRNA 表達(dá)出現(xiàn)先短暫上升后下降的趨勢(shì)，其中C57-14 d 組較C57-C 組表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01)，但整體變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見圖6。hD 組和C57組在HAdV-B55 感染后肺組織內(nèi)IFN-γ mRNA 表達(dá)水平均出現(xiàn)了輕微上調(diào)(P＜0.01)，但因表達(dá)量相對(duì)倍數(shù)差異小于1.5 倍，根據(jù)結(jié)果判讀認(rèn)為生物學(xué)意義不大。

圖6 肺組織內(nèi) IL-6 mRNA 表達(dá)量Fig.6 mRNA expression of IL-6 in lung tissues

6 血清中IL-6、IFN-γ 濃度水平比較 HAdV-B55感染后，hD 組較C57 組血清中IL-6 濃度顯著升高(P＜0.01)；血清中IFN-γ 濃度在感染病毒后無顯著變化。見圖7。

圖7 兩組血清 IL-6、IFN-γ 濃度比較(aP＜0.01)A：血清 IL-6 濃度；B：血清 IFN-γ 濃度Fig.7 Comparison of sera IL-6 and IFN-γ concentrations between the two groups (aP＜0.01)A: serum IL-6 concentration;B: serum IFN-γ concentration

討論

在既往的一些研究中，B 組人腺病毒能夠造成C57、Balb/c 等野生型小鼠肺組織短期炎癥表現(xiàn)，但病毒無法在小鼠體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，炎癥持續(xù)時(shí)間短，病毒感染的病理生理過程不完整。本研究發(fā)現(xiàn)hDSG2 轉(zhuǎn)基因小鼠采用滴鼻方式感染HAdV-B55 后，體質(zhì)量在1 d 內(nèi)較C57 小鼠顯著下降，并且隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的增加，體質(zhì)量增長(zhǎng)慢，在感染后1 周仍未恢復(fù)到感染前的原始體質(zhì)量，提示hDSG2 轉(zhuǎn)基因小鼠的疾病表現(xiàn)較C57 小鼠持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。

我們?cè)贖AdV-B55 感染小鼠的肺組織病理切片中發(fā)現(xiàn)，在感染后14 d hDSG2 轉(zhuǎn)基因小鼠較C57 小鼠的炎癥表現(xiàn)更加嚴(yán)重，而C57 小鼠炎癥表現(xiàn)呈快速自愈趨勢(shì)，說明hDSG2 轉(zhuǎn)基因小鼠的肺部感染持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。

肺系數(shù)是常用評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物急性肺損傷的指標(biāo)之一，其能夠反映出肺組織因纖維化、水腫、滲出等病理變化導(dǎo)致的肺臟器重量增加[16-17]。在感染后14 d hDSG2 轉(zhuǎn)基因小鼠肺系數(shù)顯著高于C57 小鼠，與病理結(jié)果一致，提示hDSG2 轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織炎癥反應(yīng)較C57 小鼠持續(xù)性更好。

通過比較兩組小鼠在感染后不同時(shí)間肺組織內(nèi)HAdV-B55 基因拷貝量存在的差異，我們發(fā)現(xiàn)在感染后14 d hDSG2 轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織內(nèi)HAdVB55 基因拷貝量約為C57 小鼠組的2 倍，反映出hDSG2 轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織內(nèi)病毒清除速率較C57小鼠慢，提示HAdV-B55 通過胞飲作用進(jìn)入了肺組織細(xì)胞內(nèi)，存在一定量的病毒復(fù)制。

IL-6 是一種重要的多功炎癥因子，且是提示感染性疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后的重要指標(biāo)[18-20]。本研究中，HAdV-B55 感染后hDSG2 轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織內(nèi)IL-6 mRNA 表達(dá)量顯著增加，與hDSG2 轉(zhuǎn)基因小鼠血清中IL-6 濃度水平上升相符，并且隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，hDSG2 轉(zhuǎn)基因小鼠血清IL-6 濃度始終保持相對(duì)較高的水平。而C57 小鼠肺組織內(nèi)IL-6 mRNA 表達(dá)量和血清IL-6 濃度均未出現(xiàn)顯著變化，提示HAdV-B55 感染后hDSG2 轉(zhuǎn)基因小鼠炎癥反應(yīng)較C57 小鼠更為劇烈、嚴(yán)重，也更貼近人感染HAdV 后的炎癥因子表現(xiàn)。

HAdV-B55 感染后hDSG2 轉(zhuǎn)基因小鼠和C57小鼠肺組織中IFN-γ mRNA 表達(dá)均出現(xiàn)了輕微上調(diào)，但兩種小鼠感染病毒后血清IFN-γ 濃度與對(duì)照組比較未出現(xiàn)顯著變化。病毒感染早期hDSG2 轉(zhuǎn)基因小鼠血清IFN-γ 濃度有過一過性輕度上升，而血清濃度相對(duì)較低，可能與抗病毒過程中INF-γ 的消耗有關(guān)，也可能與未形成病毒血癥有關(guān)[21]。

綜上所述，我們初步建立了 hDSG2 轉(zhuǎn)基因小鼠HAdV-B55 肺部感染動(dòng)物模型，該模型在肺感染的持續(xù)性和疾病表現(xiàn)等方面，比較接近人感染HAdV 肺炎的臨床表現(xiàn)，可借此模型進(jìn)一步深入研究HAdV-B55 的致病機(jī)制和防治措施。本研究為今后進(jìn)一步完善HAdV 感染模型打下良好的理論基礎(chǔ)，通過類似hDSG2 轉(zhuǎn)基因小鼠這類的單受體、雙受體或多受體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來突破種屬特異性，構(gòu)建更多類型的HAdV 感染動(dòng)物模型，可為研究HAdV 感染機(jī)體的機(jī)制、疾病的治療、藥物的評(píng)價(jià)和多價(jià)腺病毒疫苗的研制提供研究基礎(chǔ)。

作者貢獻(xiàn)周恩祿：總體構(gòu)思，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)分析處理，文章撰寫；張明月、韓欣潔、王俊宇：協(xié)助實(shí)驗(yàn)；孫軍平：文章修改校對(duì)；汪建新：監(jiān)督指導(dǎo)，資金獲取，文章校對(duì)。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

數(shù)據(jù)共享聲明本篇論文相關(guān)數(shù)據(jù)可依據(jù)合理理由從作者處獲取，Email：674000199@qq.com。