尿沉渣miR-150-5p 在IgA 腎病無創診斷中的價值

張 萌，段智宇，張秋月，徐解關玄，張 巖，汪 鵬，段姝偉，吳 杰，陳香美，蔡廣研

1解放軍醫學院，北京 100853；2 解放軍總醫院第一醫學中心腎臟病醫學部，解放軍腎臟病研究所，腎臟疾病國家重點實驗室，國家慢性腎病臨床醫學研究中心，腎臟疾病研究北京市重點實驗室，北京100853

IgA 腎病(IgA nephropathy，IgAN) 是全世界最常見的原發性腎小球腎炎，30%～ 40%經活檢證實的IgAN 患者在20～ 30 年內發展為終末期腎病，這種疾病在亞洲人群中尤其常見，占原發性腎小球腎炎的40%～ 50%[1]。確診IgAN 主要方法為腎穿刺活檢，這是一種侵入性檢查，不宜反復進行，且許多醫院無法開展。因此，尋找可診斷IgAN 的無創檢查生物標志物具有重要意義。

微RNA(microRNA，miRNA) 是一種大小為19～ 25 個核苷酸的內源性非編碼RNA，是基因表達的重要調節因子，通過促進mRNA 降解和(或)抑制翻譯來調節基因表達[2]。miRNA 表達水平變化與多種疾病病理過程密切相關，如腫瘤、心血管疾病、自身免疫性疾病[3-6]。尿沉渣具有無創、無痛、可反復留取的優勢，且有多種脫落細胞，包括足細胞、腎小管上皮細胞、免疫細胞和尿液中的干細胞等，可用于探索受損腎的病理變化[7]。尿沉渣miRNA 由于其部分或直接來源于腎或經腎單位排泌，具有易于獲取、存在形式相對穩定、不易被降解的優勢[8]。因此尿沉渣miRNA 成為尋找IgAN 非侵入性生物標志物的熱門方向。本研究旨在尋找具有診斷特異性的IgAN 生物標志物。

對象與方法

1 文獻研究確定候選miRNA 根據解放軍總醫院第一醫學中心團隊的Wang 等[9]、Duan 等[10]以及香港中文大學團隊的Szeto 等[11]已發表的3 項有關IgAN 尿沉渣miRNA 的芯片研究數據，比較IgAN 患者與正常人群之間的差異miRNA 數量，篩選在3 個芯片研究結果中IgAN 患者與正常人群之間表達趨勢一致且差異顯著的miRNA 作為本研究的候選miRNA。經過比較，miR-150-5p 在3 項研究的miRNA 芯片結果中表達差異顯著且趨勢一致，IgAN 組較正常對照組表達顯著升高，差異倍數分別為41.6、598.34、30.22(表1)，說明miR-150-5p 可以作為無創診斷IgAN 的潛在標志物，具有研究意義。

表1 既往IgAN 組與正常對照組尿沉渣miRNA 芯片研究結果Tab.1 Comparison of miRNAs profiles of urinary sediment in IgAN patients and normal controls in previous studies

2 研究對象 選取解放軍總醫院第一醫學中心2018 年10 月-2022 年5 月的174 例IgAN 患者、84 例非IgAN 的其他腎病患者、97 例正常人作為研究對象。IgAN 組納入標準：(1) 年齡≥18 歲；(2)經腎活檢組織病理檢查確診為IgAN。排除標準：(1)紫癜性腎炎、狼瘡性腎炎、乙肝相關性腎炎等繼發性IgAN；(2) 腎穿刺活檢病理提示合并兩種及以上其他腎病；(3) 合并有結締組織病；(4)腎穿刺活檢組織病理切片光鏡下腎小球少于8 個；(5)哺乳、妊娠期內；(6)合并泌尿系、呼吸道或胃腸道相關感染；(7) 合并有深部真菌感染、活動性結核、病毒性肝炎、惡性腫瘤；(8) 6 個月內曾使用糖皮質激素或免疫抑制劑。疾病對照(disease control，DC) 組為非IgAN 的其他腎病，包 括膜性腎病(membranous nephropathy，MN)、微小病變型腎病(minimal change disease，MCD)、局灶節段性腎小球硬化(focal segmental glomerular sclerosis，FSGS)，排除標準同IgAN。正常對照(normal control，NC) 組為解放軍總醫院第一醫學中心的醫務工作者和住院體檢患者，腎功能、尿常規結果正常，無腎病或其他嚴重疾病的個人或家族史。本研究經過解放軍總醫院倫理委員會批準(批準號：S2018-206-1)，每名參與者簽署書面知情同意。

3 研究分組及分析指標 本研究分為兩個階段，分別為小樣本驗證性預試驗階段和正式研究階段。小樣本預實驗是選取2018 年10 月-2019 年2 月的30 例IgAN 患者和30 例正常對照驗證文獻研究中IgAN 尿沉渣miRNA 芯片篩選結果的一致性。正式研究階段選取2019 年3 月-2022 年5 月的144 例IgAN 患者、84 例其他腎病患者、67 例正常對照進行研究，進一步明確miR-150-5p 是否具有診斷IgAN 特異性。84 例其他腎病患者按不同腎小球疾病分為MN 組(60 例)、FSGS 組(16 例)和MCD 組(8 例)。在腎穿前記錄所有患者的人口學信息和臨床資料，如血壓、血清白蛋白、血肌酐、腎小球濾過率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)、24 h 尿蛋白定量(24-hour urinary protein excretion，UPE)。使用慢性腎臟病流行病學協作組提出的公式來估算eGFR[12]。分析IgAN 組、NC 組、DC 組之間miRNA 表達水平的差異和不同腎小球疾病組之間miR-150-5p 表達水平的差異。

4 尿沉渣RNA 提取和實時熒光定量PCR 檢測腎活檢當天采集患者晨尿樣本50～ 100 mL，4℃、3 000 × g 離心30 min，棄上清，再4℃、13 000 × g離心5 min，棄上清，尿沉渣放于-80℃冰箱保存備用。使用Trizol (Invitrogen，美國) 從尿沉渣中提取總RNA，NanoDrop Onec分光光度計(Thermo Fisher，美國) 用于評價總RNA 的濃度(ng/μL)和純度(A260/280)，A260/280 控制在1.7～ 2.1。因后續以500 ng RNA 為體系逆轉錄，RNA 濃度控制在62.5～ 500 ng/μL，miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit(天根生化科技有限公司) 及梯度PCR 儀(4375786，Thermo Fisher，美國)用于逆轉錄。以U6 作為miRNA 檢測的內參基因[13]。引物購自天根生化科技有限公司，hsa-U6 上游引物序列為5’-GCAAGGATGACACGCAAATTC-3’，hsamiR-150-5p 上游引物序列為5’-TCTCCCAACCC TTGTACCAGTGA-3’。使用miRcute Plus miRNA qPCR Kit (SYBR Green，天根生化科技有限公司)和實時熒光定量PCR 儀(CFX96，Bio-Rad，美國)對尿沉渣miRNA 進行定量檢測，具體反應體系參考試劑盒說明書，miRNA 相對表達量采用2-ΔΔCT表示。

5 統計學處理 采用 SPSS 26.0 統計軟件進行統計學分析，采用Graphic Prism 9.4.1 繪圖。符合正態分布的計數資料以表示，組間比較使用t檢驗或單因素方差分析(One-way ANOVA)；非正態分布的計數資料以Md(IQR)表示，miRNA 表達水平的組間比較使用Mann-WhitneyU檢驗或Kruskal-Wallis 檢驗。以IgAN 組為陽性樣本，疾病對照組和正常人組為陰性樣本繪制ROC 曲線，并計算曲線下面積(area under curve，AUC)以評估診斷IgAN 的價值，P＜0.05 為差異有統計學意義。

結果

1 研究對象一般資料 小樣本研究中IgAN 組和正常對照每組各30 例，均為男17 例、女13 例，平均年齡分別為(36.30 ± 9.75)歲和(36.92 ± 10.27)歲。正式研究IgAN 組男78 例、女66 例，疾病對照組男41 例、女43 例，正常對照男33 例、女34 例；三組平均年齡分別為(36.51 ± 10.42)歲、(42.95 ± 14.32)歲、(38.50 ± 9.16)歲。見表2。

表2 研究對象的一般資料Tab.2 General information about the study participants

2 IgAN 組與正常對照 組miR-150-5p 表達水平比較 在小樣本驗證性研究中，RT-PCR 實驗顯示，IgAN 組miR-150-5p 的表達水平較正常對照組顯著升高[Md(IQR)：25.632(5.868～ 61.523)vs0.557(0.218～ 1.258)，P＜0.001]，與芯片結果一致。見圖1A。

圖1 各組間miR-150-5p 表達水平比較A：預實驗中IgAN 組與正常對照組miR-150-5p 表達水平比較；B：正式研究加入疾病對照組后各組間miR-150-5p 表達水平比較；IgAN：IgA 腎病組；DC：疾病對照組；NC：正常對照組Fig.1 Comparison of miR-150-5p expression levels among different groupsA: Comparison of miR-150-5p expression level between IgAN group and normal control in pilot study;B: Comparison of miR-150-5p expression levels among groups in a larger sample after the addition of disease control group;IgAN:IgA nephropathy;DC: disease control;NC: normal control

3 正式研究各組間miR-150-5p 表達水平的比較在加入疾病對照組后的較大樣本RT-PCR 實驗中，IgAN 組miR-150-5p 的表達水平仍顯著高于正常對照組 [Md(IQR)：12.606(3.939～ 34.431)vs0.432(0.219～ 0.890)，P＜0.001]。IgAN組miR-150-5p表達水平也顯著高于疾病對照組[Md(IQR)：12.606(3.939～ 34.431)vs2.808(1.420～ 9.616)，P＜0.001]。見圖1B。

4 miR-150-5p 在不同腎小球疾病中表達水平的比較 進一步比較miR-150-5p 在IgAN 組與不同腎小球疾病對照組之間的表達，結果提示miR-150-5p在IgAN 中表達水平較MN 和FSGS 高[Md(IQR)：14.634(4.115～ 39.160)vs2.685(1.572～ 9.838)和2.682(0.626～ 5.956)，P均＜0.001]，IgAN 與MCD 之間miR-150-5p 的表達水平無統計學差異[Md(IQR)：14.634(4.115～ 39.160)vs5.780(1.227～ 38.088)，P＞0.05]。見圖2。

圖2 miR-150-5p 在不同腎小球疾病對照組中表達水平的比較(IgAN：IgA 腎病；MN：膜性腎病；FSGS：局灶節段性腎小球硬化；MCD：微小病變型腎病)Fig.2 Comparison of expression levels of miR-150-5p in different glomerular disease control groups (IgAN: IgA nephropathy;MN: membranous nephropathy;FSGS: focal segmental glomerular sclerosis;MCD: minimal change disease)

5 尿沉渣miR-150-5p 診斷IgA 腎病的ROC 曲線以兩項研究中所有IgAN 患者為陽性樣本，所有疾病對照組和正常人組為陰性樣本，繪制ROC 曲線，miR-150-5p 的2-ΔΔCT=2.505 為最佳截斷值，對應的AUC=0.844(95%CI：0.804～ 0.885，P＜0.001)，敏感度為71.51%，特異度為84.48%。見圖3、表3。

圖3 尿沉渣miR-150-5p 診斷IgA 腎病的ROC 曲線(IgAN 組，n=174；疾病對照組，n=84；正常人組，n=97)Fig.3 ROC curve of urinary sediment miR-150-5p in diagnosis of IgA nephropathy (IgAN,n=174;DC,n=84;NC,n=97)

表3 尿沉渣miR-150-5p 診斷IgA 腎病的ROC 曲線分析Tab.3 ROC curve analysis of urine sediment miR-150-5p in diagnosis of IgA nephropathy

討論

IgAN 作為一種發病率高且呈進展性的疾病，臨床診療亟需無創且具有特異性的IgAN 診斷標志物。近十余年來，隨著各種基因芯片和質譜檢測等高通量篩選技術的發展，利用第二代測序技術進行miRNA 檢測，可同時獲取幾百萬條miRNA序列，快速鑒別出不同組織、不同階段、不同疾病狀態下的miRNA 及其表達差異，PCR 技術檢測miRNA 操作簡單、敏感度高、可重復性強、穩定性好，這些都極大地推動了IgAN 生物標志物的研究。

目前，腎活檢仍是診斷IgAN 的金標準，但腎活檢是有創的，且不易反復進行，因此IgAN 診斷需要可靠和非侵入性的生物標志物。許多研究已經探索了血液中的miRNA 作為診斷標志物并取得了一定成果，如Serino 等[14]組織了一項國際多中心回顧性研究，研究了IgAN 中兩種經典miRNA(血清miR-148b 和let-7b) 的聯合診斷價值，將血清miR-148b 和let-7b 同時納入并建立診斷預測模型，結果顯示兩種miRNA 聯合可區分IgAN 患者和健康對照、其他原發性腎小球腎炎，具有診斷特異性，AUC 為0.82，且不受糖皮質激素治療的影響。另一項研究發現，包括4 種上調miRNA(miR-148a-3p、miR-150-5p、miR-20a-5p和miR-425-3p)在內的血漿miRNA 診斷標志物組合在訓練集和驗證集ROC 曲線的AUC 分別為0.80 和0.76[15]。與人外周血單個核細胞和腎組織相比，尿沉渣具有無創易獲得、可反復留取的優勢，是2010 年以來尋找IgAN 生物標志物的熱門方向。

眾所周知，IgAN 是一種免疫性腎炎，半乳糖缺乏的 IgA1(Galactose-deficient IgA1，Gd-IgA1)是IgAN 的發病基礎，可引發自身抗體反應并形成沉積在系膜中的免疫復合物[16]。T 細胞、B 細胞在IgAN Gd-IgA1 的形成、沉積中有重要作用[17-18]。而miR-150-5p 是免疫調節功能(如T 淋巴細胞和B 淋巴細胞的增殖、凋亡和活化) 中的一種重要miRNA，在淋巴結、脾和成熟T 細胞、B 細胞中選擇性表達，參與先天性和適應性免疫反應[19]。它通過調控mTOR 表達參與T 細胞分化，被認為是淋巴細胞激活的標志物，在免疫相關疾病如再生障礙性貧血、重癥肌無力的人外周血單個核細胞、血漿中表達上調[20-23]。另外，miR-150-5p 被多次報道作為抑制因子阻礙各種腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲、發育[24-25]。在腎相關疾病中，糖尿病腎病患者血液及尿液中miR-150-5p 的表達上調已經有過報道[26-27]。Pawluczyk 等[28]在IgAN腎組織中發現miR-150-5p 的高表達，原位雜交結果提示miR-150-5p 集中表達在單核細胞浸潤處，免疫熒光染色結果提示miR-150-5p 主要來源于CD3 T 細胞，另外在CD68 巨噬細胞、CD20 B 細胞也均有表達，提示各類免疫細胞與IgAN 起病有關。因此，推測miR-150-5p 可能通過促進系膜細胞的增殖和分化，參與機體的免疫炎癥反應，在IgAN 疾病發生和進展中發揮作用。

本研究根據3 個已發表的關于IgAN 尿沉渣miRNA 芯片研究數據對比，發現在3 項研究中IgAN 組miR-150-5p 表達水平均較正常人顯著升高，具有診斷IgAN 的潛在價值。通過RT-PCR 實驗發現IgAN 中 miR-150-5p 表達水平較疾病對照組及正常對照均顯著升高，AUC=0.844，敏感度71.51%，特異度84.48%，是診斷IgAN 的特異標志物。我們的研究結果還發現miR-150-5p 的表達在IgAN 與MN、FSGS 之間有顯著差異，盡管miR-150-5p 在IgAN 與MCD 之間無顯著差異，但miR-150-5p 的表達趨勢仍是IgAN 高于MCD，暫無統計學差異可能是由于MCD 樣本例數過少，僅8 例。這表明miR-150-5p 可以較好地區分各原發性腎小球腎炎，進一步說明miR-150-5p 具有診斷IgAN 的特異性。

本研究也有一些不足之處。如所有樣本均來自單中心，且均為中國人，而不同國家和種族IgA 腎病發病率及疾病特點存在較大差異，仍需進一步驗證。

綜上所述，miR-150-5p 可作為無創診斷IgAN的潛在特異性標志物，未來仍需進一步多中心、大樣本的研究驗證及更深入的機制研究。

作者貢獻張萌：論文構思，完成實驗，收集數據，撰寫初稿；段智宇：論文構思，實驗指導，論文修訂；張秋月、徐解關玄：收集樣本，收集數據；張巖、汪鵬、段姝偉、吳杰：方法學指導，臨床問題咨詢；陳香美：資源提供，項目管理；蔡廣研：論文框架及監督指導，論文審閱修訂。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

數據共享聲明本篇論文相關數據可依據合理理由從作者處獲取，Email：zhangmeng_0305@163.com。