缺氧誘導因子-1α與X染色體連鎖凋亡抑制蛋白在人卵巢癌中的表達及意義

肖貴華, 彭星辰

(1.四川錦欣西囡婦女兒童醫院病理科,四川 成都 610011; 2.四川大學華西醫院生物治療科,四川 成都 610041)

缺氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1) 在哺乳動物細胞中廣泛表達,是缺氧誘導的全局性調控缺氧應答的因子[1,2]。HIF-1屬于DNA結合蛋白,是由氧調控性表達的α亞基(HIF-1α)與構成型表達的β亞基(HIF-1β)組成的異源二聚體,α亞基是HIF-1的功能單位, 它的表達和活性決定了HIF-1的生物活性,而HIF-1α的穩定性隨氧濃度的變化而變化[3]。X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)是新發現的凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins, IAP)新成員[4],被認為是IAP家族中抑制Caspases最強的因子之一。已經證實,XIAP在正常組織中幾乎不表達,而在乳腺癌、結腸癌、膀胱癌和急性白血病等腫瘤中都是高表達,主要是通過抑制Caspase家族活性而發揮抑制凋亡的作用[5]。本研究探討缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)與XIAP的關系,為卵巢癌的早期診斷提供新思路。

【基金項目】中華醫學會基金項目(編號:22-482)

【通訊作者】彭星辰

1 材料與方法

1.1 組織標本來自四川錦欣西囡婦女兒童醫院病理科2023年1～6月手術切除、臨床病理資料完整的石蠟包埋組織。其中:①原發性惡性上皮性卵巢癌組織30例;年齡24～73歲[(49.0 ± 9.2)歲];其中漿液性囊腺癌27例、粘液性囊腺癌3例;2例有淋巴結轉移,28例無淋巴結轉移;根據國際抗癌協會(UICC)臨床分期標準,即TNM分期法,Ⅰ期、Ⅱ期共21例,Ⅲ期、Ⅳ期共9例;②正常卵巢組織10例(來源于卵巢活檢、多發性子宮肌瘤或功能性子宮出血、子宮脫垂等病例行全子宮切除,同時行卵巢切除,且病理證實卵巢組織無異常);年齡45～66[(54.9 ± 6.4)歲];③良性卵巢腫瘤10例,全為漿液性囊腺瘤,年齡16～63歲[(49.4 ± 12.9)歲];④交界性卵巢腫瘤10例,其中6例漿液性囊腺瘤,4例粘液性囊腺癌,年齡18～75歲[(49.2 ± 14.2)歲]。所選病例臨床、病理資料完整,且患者術前未進行任何放、化療及其它抗腫瘤治療,由高年資病理科醫師復習閱片后重新制備切片。

1.2 標本及試劑本實驗所用細胞為人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細胞系SKOV-3,購自中國科學院昆明細胞庫。XIAP多克隆抗體購自武漢博士德生物試劑公司即用型;HIF-1α單克隆抗體購自北京中杉金橋試劑公司即用型;Envision試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司。XIAP、HIF-1α及β-actin引物購自上海捷瑞生物工程有限公司。PCR試劑盒購自賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 采用Envision法。標本連續切片,脫蠟、水化,用3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶活性。在pH9.0的檸檬酸鈉緩沖液中高壓修復抗原后加 入 已 稀 釋 的 一 抗HIF-1α(1∶50)、XIAP(1∶50),4 ℃孵育過夜;加入生物素標 記 的 二 抗,滴加DAB顯色劑顯色。將陽性的卵巢癌切片作為陽性對照,用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3.2卵巢癌SKOV-3細胞培養 將SKOV-3細胞培養在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液,37 ℃、5%CO2混合空氣中。將生長狀態良好(細胞長滿瓶底80%左右)的細胞放進無氧培養小室里,向小室里灌以1%氧氣+5%二氧化碳+94%氮氣的混和氣體,充氣約5分鐘,模擬細胞在小室里一個低氧環境,分別將細胞培養瓶在小室里放置12、24、36 h培養,以使癌細胞的HIF-1α基因量隨缺氧時間延長而增加;將在以上3個時間段培養的SKOV-3細胞用Trizol法提取,按照試劑說明書正確操作。

1.3.3RT-PCR檢測HIF-1α和 XIAP mRNA表達水平 取不同條件下培養的細胞RNA樣本,用核酸測定儀對RNA定量分析,采用Trizol法處理SKOV3細胞RNA,并測定RNA濃度。按TaKaRa RNAPCR(AMV) Ver3.0試劑盒說明書進行操作,PCR引物序列HIF-1α(5′-CCCTAACGTGTTATCTGTCGCT-3′,5′-ATGTTCCATTTTTCGCTTTCTCT-3′,112 bp);XIAP(5′-GCTCACCTAACCCCAAGAGAG-3′,5′-AATATTAAGATTCCGGCCCAA-3′,183 bp);β-actin(5′-CCAGGGCGTTATGGTAGGCA-3′, 5′-TTCCATATCGTCCCAGTTGGT-3′,130 bp)。PCR反應條件:95 ℃預變性3min;95 ℃ 30 s; Tm ℃ 30 s; 72 ℃; 1 min/kb;33個循環; 72 ℃終延伸10 min。取PCR產物10 μl進行瓊脂糖凝膠電泳后拍照,測量吸光度值,mRNA表達水平以每一樣品與β-actin吸光度比值表示。

1.3.4卵巢癌細胞低氧培養 12、24、36 h后檢測XIAP mRNA隨HIF-1α mRNA的光密度值(MOD)變化。

1.4 結果判定標準在切片中細胞質染成淡黃色至棕黃色為陽性標志,將陽性細胞數和顯色強度分為3級:弱陽性(+),陽性細胞數<10%,顯色強度為淡黃色或僅個別細胞為黃至棕黃色;強陽性(+++),陽性細胞數>60%,多數細胞為黃至棕黃色;中度陽性(++),陽性細胞數及強度介于前兩者之間。

1.5 圖像分析每張切片用美國MediaCybe-metics 公司生產的Image-ProPlusz圖像分析軟件(Version6.0)(IPP6.0)進行圖像分析平均光密度值(mean optical density,MOD)。

1.6 統計學方法數據采用SPSS 24.0統計學軟件。所有圖像分析結果用均數±標準差表示;兩組陽性表達率比較采用χ2檢驗、Fisher確切概率法等;各指標相關性表達用Spearman相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 凋亡抑制因子XIAP在各組織標本中陽性表達率的比較XIAP的陽性信號表達主要見于細胞漿,呈棕黃色(見圖1),其在惡性上皮性卵巢癌、交界性卵巢腫瘤及良性卵巢腫瘤中的陽性表達率分別為60%(18/30)、70%(7/10)、20%(2/10);在正常卵巢組織中無表達0%(0/10)。惡性上皮性卵巢癌中XIAP陽性表達率明顯高于良性卵巢腫瘤組,差異有統計學意義(χ2=4.900,P=0.028);交界性組XIAP陽性表達率明顯高于良性卵巢腫瘤組,差異有統計學意義(χ2=4.798,P=0.028);交界性與惡性組比較,差異無統計學意義(P=0.85)。

圖1 XIAP在人惡性上皮性卵巢癌組織中的陽性表達(EnVision,×400)

2.2 HIF-1α在各實驗組中陽性表達率的比較HIF-1α陽性信號定位于細胞漿和(或)細胞核,主要見于細胞漿,呈棕黃色(見圖2)。HIF-1α在惡性上皮性卵巢癌、交界性卵巢腫瘤、良性卵巢腫瘤及正常卵巢組織中的陽性表達率分別為60.3%(19/30)、70%(7/10)、20%(2/10)、10%(1/10)。惡性上皮性卵巢癌中HIF-1α陽性表達率明顯高于良性卵巢腫瘤組,差異有統計學意義(χ2=4.043,P=0.044);交界性組HIF-1α陽性表達率明顯高于良性卵巢腫瘤組,差異有統計學意義(χ2=4.798,P=0.028);交界性與惡性組比較,差異無統計學意義(P=1.000)。

2.3 XIAP與HIF-1α在不同臨床病理特征的上皮性卵巢癌組織中的表達臨床分期越晚(Ⅲ期+Ⅳ期)組XIAP蛋白的表達水平明顯高于臨床分期早期(Ⅰ期+Ⅱ期)組(P=0.007);XIAP蛋白表達水平與患者年齡、病理分型及淋巴結轉移無關(P>0.05)。見表1。

2.4 惡性上皮性卵巢癌組織中XIAP與HIF-1α表達的相關性在30例惡性上皮性卵巢癌組織中XIAP蛋白與HIF-1α蛋白的陽性表達率呈正相關(r=0.359,P=0.035)。

2.5 卵巢癌細胞低氧培養12、24、36 h后XIAP mRNA及HIF-1α mRNA的MOD變化低氧24 h時,SKOV3細胞系中HIF-1αmRNA表達量達高峰,36 h時HIF-1αmRNA表達量有所回落。見圖3。

圖3 卵巢癌細胞缺氧培養12、24、36 h后XIAP mRNA及HIF-1α mRNA的MOD值 a:XIAP mRNA;b:HIF-1α mRNA

2.6 缺氧組12、24、36 h,XIAP mRNA與HIF-1α mRNA相關性分析隨缺氧時間的變化,XIAP mRNA與HIF-1α mRNA呈正相關(P<0.01)。見表2。

表2 低氧12、24、36 h,XIAP mRNA與HIF-1α mRNA相關性分析

3 討論

卵巢癌占女性卵巢惡性腫瘤的90%,是婦科惡性腫瘤中死亡率最高的,近年來發病率呈明顯上升趨勢。大量研究表明,腫瘤細胞的異常增殖、浸潤及其惡性轉化與細胞凋亡調控紊亂有密切聯系。近年來對腫瘤治療的研究熱點已轉移到檢測抗凋亡因子所致的凋亡受阻在腫瘤發生、發展中的作用,進一步探討阻斷腫瘤浸潤、轉移的新方法。

XIAP是新發現的IAP新成員,被認為是IAP家族中抑制Caspases最強的因子之一,是作用最強的內源性凋亡抑制蛋白[6,7]。XIAP在正常組織中幾乎不表達,而在多種惡性腫瘤中其表達明顯升高,已經證實在乳腺癌、結腸癌、膀胱癌和急性白血病等腫瘤中XIAP都是高表達,這是導致腫瘤細胞凋亡下降、預后差的重要原因。國內外研究證實XIAP的高表達與多種腫瘤的耐藥性相關,下調其表達可促進腫瘤細胞的凋亡,增強癌細胞對化療藥物的敏感性[8～10]。本研究結果發現, XIAP在正常卵巢組織中無陽性表達,而在良性卵巢腫瘤、交界性卵巢腫瘤和惡性上皮性卵巢癌中的陽性表達率逐漸升高(P<0.01)。XIAP在惡性上皮性卵巢癌中的表達明顯高于良性,提示XIAP有可能成為診斷卵巢上皮腫瘤的一個有價值的標記物。多數學者均認為 XIAP、HIF-1α與腫瘤組織病理分型、患者年齡以及淋巴結轉移無相關性,而與腫瘤的臨床分期相關[11]。表明XIAP、HIF-1α是高度侵襲性疾病的生物標志,更加證實XIAP、HIF-1α蛋白在卵巢癌發生的不同階段的表達逐漸增高,提示預后不良。本研究結果顯示:臨床分期晚期(Ⅲ期和Ⅳ期)組的XIAP和HIF-1α的蛋白表達水平明顯高于臨床分期早期(Ⅰ期和Ⅱ期)組(P<0.05)。同時在上皮性卵巢癌中患者的年齡及有無淋巴結的轉移中發現,上皮性卵巢癌與患者的年齡、淋巴結的轉移無關(P>0.05)。進一步說明了二者高表達與腫瘤的發生發展密切相關。

HIF-1在哺乳動物細胞中廣泛表達,是缺氧誘導的全局性調控缺氧應答的因子。HIF-1屬于DNA結合蛋白,是由氧調控性表達的α亞基(HIF-1α)與構成型表達的β亞基(HIF-1β)組成的異源二聚體,α亞基是HIF-1的功能單位, 它的表達和活性決定了HIF-1的生物活性,而HIF-1α的穩定性隨氧濃度的變化而變化。受到HIF-1調控的HRG稱為HIF-1的靶基因。缺氧時,活化的HIF-1與其靶基因結合,并促進靶基因表達。這些表達產物在腫瘤新生血管的形成、腫瘤代謝和腫瘤的轉移等方面發揮著重要作用[12]。研究者用免疫組化方法檢測19種類型的人實質性腫瘤,發現其中有13種過表達HIF-1α,而且90%的腎癌、前列腺癌、肺癌及結腸癌組織中HIF-1α高表達[13]。另有研究顯示,在乳腺纖維腺瘤、子宮平滑肌瘤等良性腫瘤中無HIF-1α表達?？梢奌IF-1α的表達與腫瘤原發性、良惡性以及轉移性有密切關系。在本研究中我們用免疫組化技術檢測卵巢上皮性腫瘤組織中HIF-1α蛋白的表達情況,發現HIF-1α在細胞核和細胞漿都有表達,但主要表達于細胞漿。在惡性卵巢癌組HIF-1α的陽性表達率為60.3%,交界性腫瘤組陽性表達率為70%,良性腫瘤組為20%,組間比較差異有統計學意義。

大量研究表明,PI3K活化以后促進下游Akt磷酸化,然后促進下游靶蛋白GSK-3磷酸化,抑制HIF-1α降解,使得HIF-1α表達增加[14～17]。Akt還可通過激活下游mTOR基因的表達促進HIF-1α基因的轉錄[18]。IAPs家族中XIAP是最強有力的Caspase抑制物。XIAP有3個BIR結構域(BIR-1, -2, -3),BIR-2與BIR-1和BIR-2之間的連接區參與抑制caspase-3,-7的活性。單獨的BIR-3結構域即可抑制caspase-9,且其自身RING指結構域具有泛素連接酶活性,自身可被泛素化而降解[19]。Zhou等[20]研究還發現,XIAP的Ser87位點可被Akt磷酸化,磷酸化后的XIAP可保護其免于泛素化和降解,且Akt還可抑制XIAP的自動泛素化,增強其穩定性和在細胞內的水平,改善細胞生存,發揮抑制凋亡的作用。XIAP是Akt的新下游信號傳遞者,它在Akt的凋亡抑制作用中發揮重要作用。失去Akt磷酸化位點的突變XIAP在細胞中被迅速降解, 細胞凋亡加速。由此可見PI3K/Akt信號通路對于HIF-1α和XIAP介導的卵巢腫瘤的發生、發展關系密切,臨床可通過干預PI3K/Akt信號通路治療卵巢癌,這將成為卵巢癌治療的新靶點。