肺泡灌洗液基因甲基化聯合癌胚抗原、氣道徑向超聲對肺癌的診斷價值

陳 露,胡佩村,陳紹森

(廣東省佛山市第二人民醫院呼吸與危重癥醫學科,廣東 佛山 528000)

肺癌是最常見惡性腫瘤且死亡率高[1],肺癌的早期診斷對患者的預后有重要意義。隨著二代和三代高通量測序技術迅速發展,大量的肺癌生物標志物被挖掘發現,這彌補了早期肺癌篩查的不足[2,3]。基因甲基化是一種表觀遺傳修飾之一,目前與肺癌相關的甲基化位點超過80種[4],其中包括肺泡灌洗液中矮小同源異型盒基因2(shortstature homeobox 2,SHOX2)和RAS關聯域家族1 A(ras association domain family 1A,RASSF1A)。目前肺泡灌洗液(BALF)基因甲基化對于明確肺癌診斷并不確切。腫瘤標志物中的癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA),診斷非小細胞肺癌的特異性約80%,敏感性約60%,且其表達水平與肺癌分期相關[5～8],臨床應用廣泛。本研究通過檢測肺部病變患者的BALF中SHOX2、RASSF1A基因甲基化陽性率以及CEA水平,同時采集氣道徑向超聲圖像情況,探討上述指標在肺癌早期診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料2019年7月至2020年6月佛山市第二人民醫院經低劑量胸部CT(LDCT)提示肺結節或肺占位的114例患者。納入標準:①對照組根據病理或經相應治療后好轉診斷為肺部良性病變,肺癌組依據病理或細胞學,根據《中國原發性肺癌診療規范2015》[8]診斷為肺癌;②生命體征穩定;③意識清楚,可正常語言對答交流。排除標準:①無法耐受支氣管鏡檢查;②合并嚴重肝、腎、心功能不全;③精神異常或認知障礙。患者及其家屬均在入組前了解本項研究項目,并自愿簽署知情同意書。114例患者中經病理診斷肺癌62例(肺癌組),診斷為肺良性病變患者52例(對照組),肺癌組與對照組的年齡、性別、BMI、吸煙指數以及既往病史等比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。本研究已通過佛山市第二人民醫院臨床科研項目倫理委員會審批(編號:KJ2019003)。

表1 兩組一般資料比較

1.2 方法

1.2.1樣本采集 ①血清樣本:抽取入組患者空腹外周靜脈血5 ml,1200 r/min離心10分鐘,留存上清液待測;②氣道徑向超聲操作:患者經局麻或全麻后于內鏡室進行常規氣管鏡檢查,均經鼻入鏡,并根據胸部CT提示的病變部位,予氣道徑向超聲分別于各肺亞段進行檢測,采集超聲圖像并標記超聲進入深度。③BALF樣本:氣道徑向超聲定位后,退出超聲,將氣管鏡遠端楔在相應肺段管腔,注入37 ℃生理鹽水,灌洗3次,每次20 ml,以負壓13 kPa盡可能吸盡灌洗液,收集約40 ml灌洗液,保存待測。

1.2.2樣本的檢測 ①CEA的檢測:采用酶聯免疫法(ELISA)測定血清中CEA水平(試劑盒購自金域有限公司),檢測值>5.2 ng/ml 判斷為陽性結果。②SHOX2和RASSF1A基因甲基化檢測:按照說明書步驟對肺泡灌洗液進行DNA提取,DNA修飾, RT-PCR檢測,兩基因甲基化檢測結果任一項陽性即判讀為陽性(DNA提取試劑盒,亞硫酸鹽修飾試劑盒,SHOX2和RASSF1A基因甲基化檢測試劑盒均購自金域檢驗公司)。③氣道徑向超聲陽性結果判讀為探及病灶超聲圖像。④細胞學檢查:根據中華醫學會呼吸病學分會BALF細胞學檢測技術規范[9]方法,將細胞檢查結果分為陰性、可疑、陽性。

1.3 統計學方法使用 SPSS 26.0 統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差描述,組間比較采用t檢驗;計數資料以例數(%)描述,組間比較采用卡方檢驗;相關性分析采用Pearson相關分析法。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組SHOX2和RASSF1A基因甲基化結果比較兩組SHOX2基因陽性、RASSF1A基因陽性與任一甲基化陽性所占比例比較,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組SHOX2和RASSF1A基因甲基化結果比較 [n(%)]

2.2 肺癌組中甲基化結果與LDCT結果相關性分析甲基化陽性的40例肺癌患者中,根據胸部CT報告,肺占位最大直徑均值50.39 mm,中位數43 mm,最大直徑30～50 mm有20例(50%);甲基化陰性的22例肺癌患者中,肺占位最大直徑均值 40.28 mm,中位數28.5 mm,最大直徑10～30 mm有13例(59.09%)。肺癌組中基因甲基化與胸部CT中惡性結節大小呈負相關(r=-0.287,P<0.05)。見表3。

表3 肺癌組中甲基化結果與結節直徑大小相關性分析 [n(%)]

2.3 細胞學檢查、SHOX2和RASSF1A基因甲基化、血清CEA水平對肺癌診斷價值比較單一檢測指標診斷肺癌,細胞學檢查特異性最高 (100%),任一基因甲基化敏感性最高,細胞學檢查聯合任一基因甲基化,血清CEA聯合任一基因甲基化敏感性均高于單一檢測指標(P<0.05)。見表4。

2.4 BALF中CEA聯合SHOX2、RASSF1A基因甲基化診斷效能本研究40例BALF中同時進行SHOX2、RASSF1A的基因甲基化及CEA水平檢測,根據病理診斷肺癌患者23例,肺良性病變患者17例。肺癌患者BLAF中CEA水平≥5 ng/ml有20例,CEA聯合任一基因甲基化陽性有22例;肺良性病變患者中CEA<5 ng/ml的有12例,CEA聯合基因甲基化陰性的有11例。BALF中檢測指標CEA聯合任一基因甲基化敏感性均高于單一指標檢測(P<0.05)。見表5。

表5 CEA聯合基因甲基化對肺癌診斷價值效能

2.5 不同病理類型的肺癌BALF SHOX2、RASSF1A基因甲基化情況肺癌患者病理類型分布:鱗癌19例,小細胞肺癌6例,腺癌29例,肺肉瘤樣癌1例,組織類型不確定肺癌8例。其中SHOX2、RASSF1A甲基化陽性分布情況見表6。

表6 肺癌亞組SHOX2和RASSF1A基因甲基化結果分布情況 [n(%)]

2.6 氣道徑向超聲陽性與陰性患者肺癌SHOX2、RASSF1A基因甲基化陽性率比較62例肺癌患者中,氣道徑向超聲可探及明顯回音圖像的有49例,其中任一基因甲基化陽性的為34例(71.4%),氣道徑向超聲無探及回音圖像有13例,其中基因甲基化陰性的為8例(38.4%)。徑向超聲陽性患者基因甲基化陽性率高于徑向超聲陰性患者(χ2=4.88,P<0.05)。見表7。

表7 氣道徑向超聲陽性與陰性患者肺癌SHOX2、RASSF1A基因甲基化陽性率比較 [n(%)]

3 討論

早期肺癌的缺乏特異性癥狀,導致大部分患者在就診時已處于肺癌晚期,錯過最佳診斷和治療時機,晚期肺癌5年總體生存率小于15%[2]。早期肺癌患者得到有效治療后,5年總體生存率可上升到90%[2],因此,肺癌的早期診斷至關重要。

本研究對肺部病變患者肺泡灌洗液中SHOX2和RASSF1A基因甲基化檢測結果和CEA水平進行了分析,證實了BALF中SHOX2和RASSF1A基因甲基化聯合血清CEA可提高肺癌的診斷效能,同時在BALF中CEA有類似表現。另外,根據氣道徑向超聲定位后收集肺泡灌洗液可提高BALF基因甲基化陽性率。

表觀遺傳學機制主要是關于基因特定的表達以及個體的正常生長發育的研究[9],2010年,Schmidt等首次發現SHOX2甲基化可區分肺部良惡性病變(敏感性68%,特異性95%)[5,10]。RASSF1A是Ras信號通路的一部分,其表達缺失與肺腺癌相關[10～12]。肺癌相關DNA甲基化用于診斷早期肺癌成為研究熱點[13～15]。在本研究中,肺癌組SHOX2和RASSF1A基因甲基化陽性率明顯高于對照組,說明SHOX2或RASSF1A基因甲基化均具有鑒別肺部良惡性病變的潛能。同時,對各肺癌亞組進行分析,發現在各種類型的肺癌患者的BALF中SHOX2陽性率均高于RASSF1A基因,提示單一SHOX2甲基化對肺癌監測可能更具有敏感性。SHOX2和RASSF1A甲基化陽性率在小細胞肺癌和鱗狀細胞癌中的表現優于腺癌,這可能與中央型肺癌可釋放更多腫瘤細胞至BALF中有關。本研究顯示,肺腺癌兩組基因單獨監測的陽性率均相對較低,SHOX2基因陽性率為60%,而RASSF1A為31.85%,與雙陽性率(30%)接近,提示對于肺腺癌,RASSF1A基因甲基化特異性可能優于SHOX2。

為進一步分析腫瘤大小是否影響BALF甲基化結果,本研究根據胸部CT提示的病變部位,予氣道徑向超聲分別于各肺亞段進行檢測,采集超聲圖像并標記超聲進入深度,隨后將氣管鏡遠端楔在相應肺段管腔,灌洗及收集灌洗液送檢,通過增加定位采集方式,提高操作的同質性及灌洗液的陽性率。本研究發現,甲基化陽性的肺腫瘤直徑范圍處于30～50 mm的陽性率占52.63%,腫瘤直徑越大BALF甲基化陽性率越低,這可能與晚期巨大腫物發生壞死、出血等影響BALF內腫瘤細胞的獲取有關;而甲基化陰性的肺腫瘤直徑有59.09%處于10～30 mm,提示對于早期微小惡性肺結節,甲基化假陰性可能性大,但這可能與肺腫瘤位置、BALF技術等因素相關,尚需擴大樣本量進一步探討。

診斷肺癌的金標準是細胞學檢查,但敏感性低(38.71%),聯合BALFDNA甲基化測顯著提升細胞學檢測敏感性,同時保持較高的特異性,提示基因甲基化檢測可作為細胞學診斷的重要補充。CEA最早應用于篩查以及評價惡性腫瘤的標志物之一[6],包括原發性肺癌在內的多器官腫瘤中均可見血清CEA水平增高[2]。BALF中 SHOX2、RASSF1A基因甲基化陽性聯合血清CEA水平,診斷肺癌的敏感性由63.64%提升至81.82%,特異性由84.44%升至97.78%,診斷效能明顯提高。

腫瘤標志物是由腫瘤細胞代謝、分泌所產生,最先積聚在病灶處,繼而進入血液循環[2],對BALF直接進行腫瘤標志物檢測可能更有利于肺癌的早期診斷。故在研究后期,對收集到的40例肺癌患者BALF進行基因甲基化檢測的同時進行CEA檢測,發現BALF中SHOX2、RASSF1A基因甲基化聯合CEA檢測同樣可提高診斷的敏感性以及特異性。受限于一定客觀條件,后續研究樣本量較少,需進一步研究驗證。同時,通過對比不同標本CEA水平聯合基因甲基化在肺癌的診斷效能,血清CEA診斷肺癌的靈敏度及特異度均高于BALF,提示基因甲基化聯合血清CEA對肺癌的診斷效能優于聯合BALF中的CEA,這可能與BALF容易收到回收率、操作者熟練程度、可溶性成分等影響。

氣道徑向超聲對肺周圍型病變診斷陽性率為61.5%[16]。本研究中納入的肺部病變患者,肺癌患者在收集BALF之前均進行了氣道徑向超聲定位,結果提示氣道徑向超聲可探及回音圖像的患者,相應獲得的BALF基因甲基化陽性率較高。同時,本研究注意到肺癌患者中13例無法獲得滿意的超聲定位圖像,但在這些患者當中,5例BALFSHOX2或RASSF1A基因甲基化陽性,提示支氣管內徑向超聲聯合BALF甲基化檢測可能更有利于肺癌的診斷。另外,BALF中細胞學檢查結果容易收到標本可溶性成分影響,使檢測結果產生差異,細胞學檢查的臨床價值有限[9];而甲基化檢測作為補充,可很好地提高診斷準確率,同時BALF樣本容易獲取,降低了對基層醫院的呼吸介入技術的要求[17];CEA檢測與甲基化檢測優點相似,兩者結合檢測在操作和經濟方面具有一定優勢。

本研究仍存在著不足,包括BALF CEA收集例數過少、SHOX2和RASSF1A基因甲基化定量情況與肺癌診斷的關聯未完全明確等,均需要進一步研究。綜上,BALF SHOX2和RASSF1A基因甲基化聯合癌胚抗原、氣道徑向超聲檢查有助于肺癌的診斷,敏感性和特異性高,操作簡單,可作為早期肺癌篩查工具。