人類白細胞抗原-I類在錯配修復缺陷型子宮內膜癌中的表達及其臨床意義

竹 萱,郭晶晶,謝文龍,肖 雪

(1. 成都中醫藥大學醫學與生命科學學院,四川 成都 610072;2. 四川省醫學科學院·四川省人民醫院病理科,四川 成都 610072)

人類白細胞抗原(humall leukocyte antigen, HLA)-I類是一種在有核人類細胞上表達的膜結合蛋白復合體,在細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)介導的抗腫瘤免疫中起著非常重要的作用[1]。HLA-I類參與抗原遞呈和CTL的激活,其在腫瘤細胞中的正常表達是CTL識別和殺傷腫瘤細胞的必要條件[1, 2]。HLA-I類在腫瘤細胞中表達缺失會減少腫瘤抗原的呈遞,影響CTL的激活,從而導致免疫逃逸和免疫治療耐藥[2]。目前錯配修復缺陷/高度微衛星不穩定(mismatch repair deficiency, MMRd/microsatellite instability-high, MSI-H)型腫瘤對免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitor,ICI)具有較高的響應率[3, 4]。但是這些MMRd/MSI-H腫瘤也有可能因為HLA-I類的表達缺失對ICI不敏感。由于目前缺乏該分子在MMRd型腫瘤中表達情況的研究,故本文主要研究HLA-I類在MMRd型子宮內膜癌中的表達情況,其與CTL細胞浸潤情況以及其它臨床病理特征的關聯。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集四川省人民醫院病理科2017年1月至2021年3月的子宮內膜癌組織MMRd腫瘤樣本90例。納入標準:病理診斷子宮內膜癌,至少有一種MMR蛋白缺失,且具有足夠的樣本進行后續實驗。排除標準:術前曾接受過針對腫瘤的治療,或同時患有其它類型的腫瘤。所有石蠟包埋(FFPE)樣本均再次進行切片和HE染色,并由兩位病理醫師復核診斷結果。隨后根據MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的表達情況,判定是否為MMRd腫瘤(見圖1)。選取TCGA數據庫中MSI-H子宮內膜癌患者147例,分析mRNA水平HLA-A、HLA-B以及HLA-C以及CD8A這四個基因的表達情況。

圖1 1例代表性的子宮內膜癌MMRd腫瘤 (×200) a:腫瘤HE染色示例;b:MSH2表達正常(IHC染色);c:MLH1表達缺失(IHC染色);d:PMS2表達缺失(IHC染色)。

1.2 方法免疫組織化學(immunohistochemistry, IHC)染色 對每一例FFPE樣本進行連續切片,隨后在60 ℃下孵育1小時。經過二甲苯脫蠟,梯度酒精復水,抗原修復后,用3% H2O2進行阻斷,然后對MLH1(克隆ES05)、MSH2(克隆RED2)、MSH6(克隆EP49)、PMS2(克隆EP51)、CD8(克隆SP16)以及HLA Class I ABC(克隆EMR8-5)進行染色。一抗4 ℃過夜孵育后,用二抗孵育30分鐘,隨后進行DAB顯色(Dako REALTMEnVisionTM)。最后用蘇木素染色并封片。由于通過IHC檢測的MMRd結果和MSI-H的一致性高達90%以上,因此本研究未對樣本進行MSI-H的檢測[5]。

1.3 結果判讀

1.3.1MMR狀態的判讀 MMRd定義為腫瘤細胞中任何一種MMR蛋白(MLH1、MSH2、MSH6和PMS2)的核染色完全缺失,且存在陽性的內部對照(淋巴細胞、間質細胞或正常子宮內膜)[6]。腫瘤細胞中四種MMR蛋白均表達的腫瘤判定為錯配修復正常(mismatch repair proficiency, MMRp)[6]。

1.3.2CTL密度的判定 CD8+TILs被判定為CTL。CTL的密度以浸潤到腫瘤細胞區域的CD8+TILs的數量來評價。對于每個樣本,從五個隨機選擇的高倍視野(High power field, HPF)中對CD8+TILs計數,再取平均值作為該樣本的CD8+TILs密度[7]。

1.3.3HLA-I類表達狀態的判讀 HLA-I類正常(+)定義為>90%的腫瘤細胞具有該蛋白的膜和/或細胞質表達;HLA-I類部分缺失(±)定義為10%～90%的腫瘤細胞表達該蛋白;HLA-I類陰性(-)定義為<10%腫瘤細胞表達該蛋白。HLA-I(±)腫瘤和HLA-I(-)腫瘤均屬于HLA-I缺失[8]。

1.4 TCGA數據驗證HLA-I類和CD8+TILs浸潤情況的關聯從TCGA數據庫中篩選出147例MSI-H子宮內膜癌,隨后對組成HLA-I類的三個基因HLA-A、HLA-B以及HLA-C的mRNA表達豐度和CD8A 的mRNA表達豐度進行相關性分析。

1.5 統計學方法采用GraphPad Prism 9進行統計分析。正態分布數據用均值±標準差表示,非正態分布計量數據采用M(Q1,Q3)表示,采用Mann-WhitneyU檢驗。組間率的比較采用Chi-square或Fisher′s exact檢驗。Pearson相關分析用于衡量兩組變量之間的線性關系。采用Kaplan-Meier法計算生存曲線,采用Log-rank檢驗確定其統計學意義。繪制ROC曲線圖分析HLA-I類IHC染色對CTL密度的預測價值。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MMRd腫瘤的臨床病理特征90例MMRd腫瘤患者年齡(55.5±7.7)歲;其中子宮內膜樣型86例(95.5%);低級別70例(77.7%);76例為早期(84.4%)。56例具有MLH1和PMS2表達缺失(62.2%),16例具有MSH2和MSH6表達缺失(17.8%),18例具有MSH6單獨缺失(20%)。

2.2 不同臨床病理參數中HLA-I類表達狀態的比較90例MMRd腫瘤中,僅有48例(53.3%)HLA-I類表達正常(+)(圖2a),30例(33.3%)為部分缺失(±)(圖2b),12例(13.3%)為完全缺失(-)(圖2c)。相比HLA-I類表達正常的腫瘤,HLA-I類缺失腫瘤中CD8+TILs的密度顯著更低(P=0.0236)。不同組織學類型、腫瘤級別、腫瘤分期等其它臨床病理特征之間,HLA-I類表達狀態比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理參數中HLA-I類表達狀態的比較

圖2 子宮內膜癌MMRd腫瘤HLA-I類表達及CD8免疫組化染色示例 a:HLA-I類表達正常;b:HLA-I類部分缺失;c:HLA-I類完全缺失;d:腫瘤中的CD8+TILs (IHC染色,×200)

2.3 MMRd腫瘤中HLA-I類mRNA表達和CD8A mRNA表達的關系通過對TCGA數據庫中147例MSI-H子宮內膜癌的分析,發現在mRNA水平HLA-A、HLA-B以及HLA-C基因的表達都和CD8A的表達呈正相關(r=0.4395;r=0.4543;r=0.3837,P<0.05)。見圖3。

圖3 mRNA水平HLA-I類表達和CD8A表達的相關性 a:HLA-A和CD8A呈正相關;b:HLA-B和CD8A呈正相關;c:HLA-C和CD8A呈正相關

2.4 MMRd腫瘤中HLA-I類表達對CD8+TILs密度的預測價值HLA-I類IHC染色狀態曲線下面積為0.7613,對CD8+TILs密度具有較好的預測價值。見圖4。

圖4 HLA-I類表達免疫組化檢測對CD8+TILs的浸潤情況的預測價值ROC曲線

3 討論

近年來ICI已成為子宮內膜癌患者的一種選擇,MMRd/MSI-H也被FDA批準為篩選接受ICI治療的患者的標志物[9]。其機理在于MMRd/MSI-H腫瘤會因為錯配修復功能的缺陷導致腫瘤中累積大量的突變,繼而產生很多新抗原,因此更容易被CTL識別和殺滅[4, 10]。然而臨床數據顯示大約一半的MMRd/MSI-H子宮內膜癌對ICI治療并不敏感[11～13],提示還需考慮其它因素才能更有效地篩選對ICI敏感的患者。因此在MMRd/MSI-H的基礎上,探尋補充性的標志物對提高ICI的治療效果具有重要的意義。

ICI產生療效的前提條件是CTL識別腫瘤細胞后發揮其殺傷腫瘤細胞的作用[2]。HLA-I類對腫瘤抗原呈遞和CTL激活至關重要,該分子在腫瘤細胞的有效表達是CTL殺傷腫瘤細胞的必要條件[14]。因此,CTL的抗腫瘤效應會受到HLA-I類功能的影響。多種惡性腫瘤中都存在該分子的表達異常,從而限制CTL的激活和對腫瘤細胞的識別,導致免疫逃逸和對免疫治療的抵抗[1, 14]。

Friedman等曾報道HLA-I類在子宮內膜癌中的缺失非常普遍[8],而本研究發現即便在腫瘤突變負荷很高的MMRd子宮內膜癌中,該分子的缺失比例也達到了近50%,提示該分子及其介導的抗原呈遞通路失活在子宮內膜癌發生發展中起到重要作用。由于腫瘤中CD8+TILs密度和ICI的治療敏感性高度相關,我們希望了解HLA-I類能否作為一種標志物來預測MMRd腫瘤中CD8+TILs的浸潤情況,從而間接反應腫瘤對ICI治療是否敏感。IHC結果顯示HLA-I類的表達情況能較準確地預測CD8+TILs密度。

HLA-I類分子缺失可能由遺傳、表觀遺傳、轉錄和轉錄后改變引起,從而導致其表達的不可逆或可逆變化[15～17]。不可逆的HLA-I類缺失往往由于關鍵基因的結構改變而產生,比如HLA-I類重鏈基因、β2M和TAP編碼基因;而可逆性缺失往往和這些基因的轉錄或轉錄后下調有關[15, 18]。由于我們未對這些基因進行結構變異和轉錄分析,因此無法判斷這些MMRd子宮內膜癌HLA-I類分子缺失的原因。近年來的研究顯示針對可逆性的缺失,靶向HLA-I類抗原呈遞的相關通路,特別是NF-κB,IFN和NLRC5,能逆轉HLA-I類的表達[19～23]。因此,這些通路也成為了腫瘤免疫治療的潛在靶點。

綜上所述,由于該分子對腫瘤抗原向CTL的呈遞至關重要,盡管MMRd/MSI-H腫瘤中具有大量的新抗原,HLA-I類缺失的腫瘤也很可能會因為抗原呈遞的失敗導致CTL無法激活并聚集到腫瘤細胞區域,從而對免疫治療不響應。HLA-I類的IHC染色可能作為一種結合MMRd/MSI-H的補充性生物標志物,用于篩選ICI治療候選患者,避免對該療法不響應的患者使用這類藥物。