神經(jīng)系統(tǒng)免疫病自身抗體檢測(cè)方法學(xué)進(jìn)展及在診斷中的應(yīng)用

李 科,閆亞平

(陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,西安 陜西 710119)

神經(jīng)系統(tǒng)疾病種類繁多癥狀復(fù)雜一直困擾著臨床,近幾十年里,陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的抗神經(jīng)細(xì)胞自身抗體逐漸將一部分神經(jīng)系統(tǒng)疾病解釋清楚。這類疾病損傷范圍廣泛,從中樞神經(jīng)系統(tǒng)到外周神經(jīng)及神經(jīng)肌肉接頭,可引發(fā)各種神經(jīng)精神性的病變表現(xiàn),只有做到早診斷早治療,才有緩解或治愈的可能。自身抗體檢測(cè)陽性逐漸成為此類疾病診斷的重要證據(jù),視神經(jīng)脊髓炎譜系病(NMOSD)的AQP4抗體及自免性腦炎(AE)的NMDAR抗體是兩個(gè)典型的例子[1, 2]。抗體的發(fā)現(xiàn)和診斷意義的確定大幅度推動(dòng)了神經(jīng)自免病領(lǐng)域的研究進(jìn)展。抗體檢測(cè)新技術(shù)也隨之不斷被開發(fā)出來,用于疾病診斷,新自身抗體的發(fā)現(xiàn),以及治療效果評(píng)估及預(yù)后判斷。本文將對(duì)神經(jīng)免疫病自身抗體檢測(cè)的方法學(xué)進(jìn)展及其在疾病診斷中的應(yīng)用做一個(gè)介紹。

1 神經(jīng)系統(tǒng)自身抗體

神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病是免疫分子或細(xì)胞攻擊神經(jīng)系統(tǒng)引起的疾病,有廣泛的臨床表現(xiàn),包括感覺運(yùn)動(dòng)異常、認(rèn)知意識(shí)障礙、行為或精神異常等。根據(jù)目前一些抗體與疾病的相關(guān)性研究,人們普遍認(rèn)為自身抗體可視為神經(jīng)系統(tǒng)自免病的分子標(biāo)志物。根據(jù)抗原在神經(jīng)細(xì)胞中的定位,可將自身抗體分為兩類:一類是神經(jīng)系統(tǒng)副腫瘤綜合征(PNS)相關(guān)自身抗體,抗原位于細(xì)胞胞內(nèi)(比如GAD抗體)或胞核內(nèi)(比如Yo抗體),正常情況下抗體與抗原并無直接接觸的機(jī)會(huì),一般認(rèn)為沒有直接的致病性;一類是自免性腦炎相關(guān)自身抗體,抗原一般位于細(xì)胞或神經(jīng)突觸表面,通常是離子通道,受體等,有直接致病性的抗體一般屬于這一類。神經(jīng)系統(tǒng)自身抗體產(chǎn)生的原因尚不十分清楚。一般認(rèn)為基于下面幾種機(jī)制。

1.1 免疫檢查點(diǎn)異常自身反應(yīng)性B細(xì)胞逃避中樞和外周的耐受檢查點(diǎn),產(chǎn)生幾個(gè)B細(xì)胞亞群分泌自身抗體,持續(xù)的生發(fā)中心反應(yīng)和長(zhǎng)壽命漿細(xì)胞則加劇了自身抗體的產(chǎn)生[3]。臨床上使用CTLA4或PD1/PDL1檢查點(diǎn)抑制劑進(jìn)行腫瘤治療時(shí),會(huì)較為罕見的誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)自免病或使其加重,可能與藥物誘導(dǎo)了自身抗體(多為抗Ma2, Hu, Yo, GABABR及NMDAR抗體)產(chǎn)生有關(guān)[4, 5]。

1.2 腫瘤相關(guān)抗體腫瘤組織上異常表達(dá)神經(jīng)組織抗原蛋白,抗腫瘤免疫反應(yīng)與之發(fā)生交叉反應(yīng)產(chǎn)生自身抗體。抗NMDAR抗體腦炎伴有卵巢畸胎瘤時(shí)會(huì)異位表達(dá)NMDAR,并有致密的B細(xì)胞和T細(xì)胞浸潤(rùn),表明免疫反應(yīng)可能在腫瘤處發(fā)生[6]。

1.3 感染相關(guān)抗體水痘病毒、HHV6、及COVID-19等感染時(shí)病毒蛋白或細(xì)胞壞死釋放蛋白異常產(chǎn)生自身抗體。單純皰疹病毒性腦炎患者傾向于發(fā)展為抗NMDAR抗體腦炎[7],COVID-19感染者中抗胞內(nèi)蛋白抗體陽性率明顯增多[8, 9]。復(fù)雜情況下自身抗體可能是由多種原因產(chǎn)生的,組織器官移植后出現(xiàn)的移植物抗宿主病[10]會(huì)有罕見的中樞神經(jīng)癥狀,像骨髓移植出現(xiàn)抗LGI1抗體自免腦炎[11],干細(xì)胞移植出現(xiàn)抗GABAAR抗體腦炎[12]。

胎兒體內(nèi)也可檢出經(jīng)母嬰傳遞(maternal-fetal transfer)來的自身抗體。妊娠中期IgG分子可經(jīng)過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi),再經(jīng)尚不完整的血腦屏障進(jìn)入胎兒中樞引起病理反應(yīng),這些抗體的影響可以是長(zhǎng)遠(yuǎn)的,有可能伴隨子代一生[13, 14]。妊娠中的自身抗體即便未對(duì)母體產(chǎn)生影響,但仍有可能影響到胎兒發(fā)育,像synapsin-I(SYN1)抗體在妊娠母體的檢出率可達(dá)13.3%,可進(jìn)入胎兒體內(nèi)并導(dǎo)致胎兒的器官結(jié)構(gòu)發(fā)育異常和神經(jīng)精神發(fā)育疾病等[15]。

抗細(xì)胞表面抗體可以直接接觸神經(jīng)細(xì)胞表面分子,致病機(jī)制包括:①抗體影響細(xì)胞膜上受體的分布或促其內(nèi)化,導(dǎo)致神經(jīng)元功能異常,如NMDAR[16]抗體。②抗體破壞抗原蛋白相互作用,如抗LGI1抗體阻斷LGI1及其受體ADAM22/23的相互作用,進(jìn)而影響下游信號(hào)通路[17]。③抗體刺激或拮抗受體,如GABABR[18]。④抗體-抗原復(fù)合物激活補(bǔ)體殺傷細(xì)胞以及抗體依賴性細(xì)胞毒性,如AQP4抗體[19]。MOG抗體在體外研究也發(fā)現(xiàn)有此機(jī)制,不過在體內(nèi)需要同時(shí)有髓磷脂活化的T細(xì)胞的存在[20]。⑤抗體通過胞吞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)引起病理反應(yīng),比如SYN1抗體[21]。

過去十年內(nèi)有數(shù)十種新自身抗體被報(bào)道,例如抗LUZP4,ATP1A3、SEZ6L2、syntaxin1B(STX1B)、GluRD2(GRID2)、PDE10A、AP3B2、septin3/5/6/7/11抗體等。由于神經(jīng)系統(tǒng)自免病罕見,自身抗體有很高的診斷意義,許多新抗體一經(jīng)發(fā)現(xiàn),在實(shí)驗(yàn)室研究的同時(shí)即已應(yīng)用到臨床診斷中。基于細(xì)胞的間接免疫熒光染色技術(shù)(cell based assay,CBA)已成為大多數(shù)抗體檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn),可用于臨床診斷常規(guī)操作。使用嚙齒動(dòng)物或靈長(zhǎng)動(dòng)物腦切片,基于組織的間接免疫熒光染色技術(shù)(tissue based assay,TBA)或者培養(yǎng)的原代神經(jīng)元進(jìn)行間接免疫熒光,可以驗(yàn)證CBA檢測(cè)結(jié)果,也可以指示新的自身抗體。

2 神經(jīng)系統(tǒng)自身抗體檢測(cè)方法

2.1 免疫印跡技術(shù)(包括western blot,免疫斑點(diǎn)/線技術(shù))通常用于檢測(cè)胞內(nèi)抗原的自身抗體,如Hu, Yo抗體等,有很好的檢測(cè)靈敏性。重組純化的抗原固化在硝酸纖維素膜上(以小圓點(diǎn)/細(xì)線的形式),與患者樣品孵育,再與酶標(biāo)記的抗人IgG或IgM等免疫球蛋白的抗體孵育,之后加入底物使酶-底物發(fā)生顯色反應(yīng),根據(jù)反應(yīng)后顯色深淺來判斷抗體含量。Western blot方法是經(jīng)過電泳轉(zhuǎn)膜操作后再來檢測(cè)自身抗體,參考了蛋白分子量,所以準(zhǔn)確性高于免疫斑點(diǎn)/線方法,但操作也更復(fù)雜。一個(gè)試紙條上不同位置固化多種抗原,就可以多通量地同時(shí)檢測(cè)多種抗體。缺點(diǎn)是這種方法的抗原構(gòu)象在蛋白純化過程中會(huì)受到破壞,檢測(cè)AQP4抗體這類識(shí)別空間構(gòu)象的抗體時(shí)會(huì)有比較高的假陰性率。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)ELISA是將重組抗原包被在96孔板的孔內(nèi),使用患者樣品及酶標(biāo)抗人免疫球蛋白二抗進(jìn)行孵育,再經(jīng)過酶底物顯色,使用分光光度技術(shù)來測(cè)定自身抗體含量。ELISA技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟,自動(dòng)化檢測(cè)設(shè)備使抗體檢測(cè)頗為便捷。缺點(diǎn)類似免疫印跡法,不適合檢測(cè)識(shí)別構(gòu)象的抗體。ELISA方法還因不適合多種抗體同時(shí)檢測(cè),在患者診斷檢測(cè)時(shí)很少會(huì)被用到。

2.3 放射性免疫沉淀技術(shù)(RIA)RIA多用來檢測(cè)抗神經(jīng)元突觸部位蛋白的抗體,尤其是檢測(cè)一些由多個(gè)蛋白亞基構(gòu)成的復(fù)合物的抗體,如抗AchR抗體、抗VGCC復(fù)合物抗體等。一般是使用放射性元素如碘125,標(biāo)記重組抗原蛋白或有抗原表達(dá)組織/細(xì)胞勻漿物,與樣品中自身抗體孵育后,加入一定比例的抗人IgG二抗或使用protein A/G瓊脂糖使抗體-抗原沉淀下來,通過檢測(cè)沉淀物的放射活性來分析自身抗體有無及含量。近年來放免法逐漸被其他方法(主要是CBA)取代。VGKC自身抗體中有臨床意義的是抗LGI1和CASPR2兩個(gè)蛋白,放免法被檢測(cè)這兩個(gè)抗體的CBA方法所取代[22];在AchR抗體檢測(cè)上,CBA檢測(cè)也被認(rèn)為是靈敏度更高,對(duì)臨床更有益處的檢測(cè)方法[23, 24]。

2.4 CBACBA方法是在真核細(xì)胞(HEK293等)上過表達(dá)抗原蛋白,將活細(xì)胞或經(jīng)固定處理的細(xì)胞與患者樣品孵育,再使用熒光標(biāo)記的抗人免疫球蛋白(IgG,IgM,及IgA等)的抗體進(jìn)行孵育,最后通過熒光顯微鏡直接觀察,或者使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。CBA方法的優(yōu)點(diǎn)是位于細(xì)胞表達(dá)原位的抗原蛋白,相對(duì)于重組純化的蛋白來說,可以更好地保留空間構(gòu)象,有利于那些識(shí)別構(gòu)象抗原位點(diǎn)的自身抗體的檢出。與TBA相比,CBA實(shí)驗(yàn)對(duì)操作者要求較低,檢測(cè)結(jié)果判斷簡(jiǎn)單,只需要對(duì)實(shí)驗(yàn)組(過表達(dá)抗原的細(xì)胞)及對(duì)照組(轉(zhuǎn)染空載載體的細(xì)胞)間的熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行比較,并結(jié)合少許陽性細(xì)胞形態(tài)的分析即可做出判斷。CBA方法只能用來檢測(cè)明確抗原的自身抗體,因此在尋找新自身抗體時(shí)一般是通過TBA而不是CBA來找到抗體存在的證據(jù)。

活細(xì)胞CBA和固定細(xì)胞CBA都被用來進(jìn)行抗體檢測(cè),活細(xì)胞一般被認(rèn)為保留了抗原最原始的構(gòu)象,又由于活細(xì)胞細(xì)胞膜對(duì)抗體是不通透的,因此更適合檢測(cè)識(shí)別表面抗原的抗體,如抗AQP4、MOG、GlyR[25]等。固定細(xì)胞的細(xì)胞膜通透,抗體可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,可以用來檢測(cè)抗表面抗體及胞內(nèi)抗體。固定細(xì)胞CBA(商業(yè)化的試劑)在檢測(cè)抗NMDAR抗體時(shí),檢測(cè)血清樣品靈敏度為86%,腦脊液樣品靈敏度92%,而活細(xì)胞CBA在血清樣品上可以獲得更高的靈敏度;在MOG自身抗體檢測(cè)時(shí),活細(xì)胞CBA也有更好的準(zhǔn)確度,尤其是使用特異識(shí)別人IgG1二抗時(shí)[26, 27]。雖然有研究表明活細(xì)胞CBA在幾個(gè)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室之間有較好的一致性[28],但是細(xì)胞轉(zhuǎn)染及染色操作等技術(shù)專業(yè)要求和時(shí)效性會(huì)限制其在臨床實(shí)驗(yàn)室的使用。研究者認(rèn)為目前過分關(guān)注細(xì)胞差別并無太多臨床意義,抗體檢測(cè)的時(shí)效性及可靠性(標(biāo)準(zhǔn)一致)更為關(guān)鍵[29]。

為明確各試樣調(diào)制系數(shù)隨電壓的增長(zhǎng)速率，對(duì)特定激勵(lì)超聲頻率的各階模態(tài)調(diào)制系數(shù)曲線進(jìn)行一元線性回歸分析，即根據(jù)若干實(shí)測(cè)點(diǎn)確定調(diào)制系數(shù)y與低頻電壓x的關(guān)系，回歸函數(shù)記為

活細(xì)胞CBA試劑難以保存運(yùn)輸,目前只能實(shí)驗(yàn)室自建方法,固定細(xì)胞CBA則已有多種商業(yè)化產(chǎn)品上市,使用商業(yè)化CBA試劑適合在不同實(shí)驗(yàn)室達(dá)成共識(shí),減少臨床結(jié)論的分歧。商業(yè)化CBA試劑可以用于單項(xiàng)抗體檢測(cè),也可以將多種過表達(dá)細(xì)胞載片(單個(gè)尺寸1～5 mm2)組合在一張載玻片上,形成多通量檢測(cè)試劑,用于多種自身抗體同時(shí)檢測(cè)。隨著大量新自身抗體快速被報(bào)道,當(dāng)前的多通量檢測(cè)試劑逐漸顯露出局限之處:需要大量增加細(xì)胞爬片以適應(yīng)日益增多的新自身抗體數(shù)量,在成本及技術(shù)上對(duì)生產(chǎn)廠商都是越來越大的挑戰(zhàn);實(shí)驗(yàn)人員也需要熟悉越來越多的陽性信號(hào)典型形態(tài);檢測(cè)操作也變得冗繁。這些都影響著新報(bào)道的抗體及時(shí)應(yīng)用到臨床。實(shí)驗(yàn)操作及結(jié)果判斷自動(dòng)化,同時(shí)使用更高通量的形式,比如檢測(cè)芯片或者更高通量的流式細(xì)胞術(shù)等,有希望解決這種問題。

其中一種可行的解決方案是改變CBA試劑的形式[30]。保留CBA的抗原有天然構(gòu)象的優(yōu)點(diǎn),將過表達(dá)細(xì)胞的膜-抗原復(fù)合物提取出來,固化到硝酸纖維素試紙條上,這個(gè)過程中控制條件使抗原空間構(gòu)象不被破壞,之后使用免疫斑點(diǎn)法進(jìn)行抗體檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)最終采用酶-底物顯色方式,只需要根據(jù)顏色深淺來判斷結(jié)果,不需要顯微鏡等設(shè)備,也不需要實(shí)驗(yàn)者持續(xù)訓(xùn)練來熟悉陽性細(xì)胞形態(tài)。目前這個(gè)方法在AQP4抗體檢測(cè)上獲得良好的結(jié)果,在多個(gè)實(shí)驗(yàn)中心與CBA方法比較均有非常好的一致性[30]。這種技術(shù)如果應(yīng)用到更多的自身抗體檢測(cè)中,比如MOG,NMDAR等抗體,一方面有利于床旁檢測(cè),方便在社區(qū)醫(yī)院或者檢測(cè)設(shè)備欠齊全的機(jī)構(gòu)進(jìn)行抗體檢測(cè)[30];一方面便于開發(fā)抗表面自身抗體的高通量篩查試劑,在檢測(cè)成本及效率上均有希望優(yōu)于傳統(tǒng)的CBA方法。

2.5 TBATBA也稱為IIFA/TIF/TIIF,是在固定的嚙齒或靈長(zhǎng)動(dòng)物神經(jīng)組織切片上,使用患者樣品進(jìn)行間接免疫熒光/組化染色,來判斷樣品中有無自身抗體。一般會(huì)用到動(dòng)物大腦(尤其是皮層、海馬、丘腦等部位)、小腦、腦干、基底節(jié)、脊髓、外周神經(jīng)、及肌肉(神經(jīng)肌肉接頭)等部位的組織切片。切片的不同固定條件及預(yù)處理方法,像使用甲醛、丙酮或其他固定試劑,以及快速冷凍切片后固定或先灌注固定蔗糖脫水后再冷凍切片等,會(huì)影響到不同抗體的檢出[31],同時(shí)使用多種方式處理的組織切片可有利于抗體信號(hào)的檢出。神經(jīng)組織切片內(nèi)含有各種抗原,可檢出已報(bào)道的或未知的各種自身抗體,常用于新自身抗體研究中的樣品篩查。

一些自身抗體的TBA信號(hào)模式被研究者描述的非常細(xì)致[31],理論上可根據(jù)信號(hào)模式推斷自身抗體種類。不過有些種類的自身抗體信號(hào)模式比較接近,操作者需要大量訓(xùn)練熟知各種信號(hào)模式,并且樣品中可能有不只一種抗體,以及同一類自身抗體可能存在抗體異質(zhì)性,導(dǎo)致TBA信號(hào)模式并不總是清晰易辨。臨床診斷時(shí)TBA需要結(jié)合抗原明確的CBA或者免疫斑點(diǎn)/線方法來使用。

目前對(duì)TBA與CBA方法的整體靈敏度及特異性的比較缺少明確結(jié)論,原因除了研究的抗體不同,樣品入組標(biāo)準(zhǔn)或樣品范圍也不同,以及TBA實(shí)驗(yàn)操作和結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)或有不同。一些已知的自身抗體,TBA較CBA檢測(cè)靈敏度低的一個(gè)原因可能是組織內(nèi)源表達(dá)抗原量較CBA過表達(dá)體系低,TBA使用的是動(dòng)物組織切片,動(dòng)物與人的抗原序列存在差異,使其不適宜用于某些抗體檢測(cè)[32]。TBA如果不限于具體某自身抗體的驗(yàn)證,而用在判斷有無抗體存在時(shí)有明顯優(yōu)勢(shì)[33, 34]。有學(xué)者對(duì)TBA信號(hào)“模式”的診斷意義進(jìn)行研究[35],通過對(duì)AE患者急性期收集腦脊液樣品進(jìn)行TBA實(shí)驗(yàn),TBA信號(hào)模式可分為兩類:神經(jīng)纖維網(wǎng)模式和GFAP模式,其中以神經(jīng)纖維網(wǎng)模式信號(hào)預(yù)測(cè)抗神經(jīng)元抗體的靈敏度為66%,特異性為98.2%,明顯高于常用的幾個(gè)傳統(tǒng)自身抗體的檢測(cè)靈敏度。有專家建議在患者就診時(shí)如果懷疑AE等疾病,可先使用TBA檢測(cè),陽性樣品再輔以CBA或免疫印跡等確定自身抗體種類,這樣可縮短確診時(shí)間并提高診斷AE的準(zhǔn)確度[33, 36]。

2.7 單細(xì)胞水平檢測(cè)及抗體重組該方法所需技術(shù)水平較高,更適用于實(shí)驗(yàn)室研究,而非臨床診斷。在一些患者自身抗體檢測(cè)為陰性的情況下,如能找到產(chǎn)生自身抗體的細(xì)胞加以擴(kuò)增,可以提高檢測(cè)靈敏度[37]。方法是收集患者外周血或腦脊液,使用流式細(xì)胞分選等技術(shù)分離單個(gè)B細(xì)胞,進(jìn)行單細(xì)胞克隆培養(yǎng),并使用CBA方法檢測(cè)培養(yǎng)液中的抗體表達(dá)情況,挑選出生產(chǎn)自身抗體的單細(xì)胞克隆,克隆抗體表達(dá)序列并重組抗體[37]。采用單細(xì)胞技術(shù)研究的自身抗體已有AQP4、MuSK、AchR、NMDAR、MOG、LGI1抗體[3],可以在無其它抗體干擾的情況下精確分析抗體的抗原識(shí)別位點(diǎn)、親和力、致病機(jī)制、組織損傷位置等。神經(jīng)系統(tǒng)免疫病自身抗體各種檢測(cè)方法的系統(tǒng)比較見表1。

表1 神經(jīng)系統(tǒng)免疫病自身抗體檢測(cè)方法比較

3 樣品類型及檢測(cè)流程

神經(jīng)系統(tǒng)自身抗體多數(shù)是外周骨髓產(chǎn)生,一部分抗體會(huì)在鞘內(nèi)合成,或者通過病理損傷的血腦屏障進(jìn)入中樞。多數(shù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身抗體可在血清及腦脊液中同時(shí)檢出,如NMDAR抗體;有些抗原及病理部位遠(yuǎn)離神經(jīng)中樞,其自身抗體只存在血清中,腦脊液中很少被檢出,如抗AchR抗體。在臨床上血清樣品比腦脊液樣品更容易獲得,尤其在監(jiān)測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的抗體水平時(shí),多次抽取患者血樣比較容易實(shí)現(xiàn)。血清中高濃度的無關(guān)抗體往往是導(dǎo)致假陽性檢測(cè)結(jié)果的原因,腦脊液中無關(guān)抗體含量較少,用于檢測(cè)會(huì)有更好特異性。一些AE自身抗體可以由鞘內(nèi)產(chǎn)生的,并且有直接的致病性,因此中樞自免病檢測(cè)腦脊液樣品更有臨床意義。腦脊液取樣是侵入性的,不便于長(zhǎng)期頻繁取樣。腦脊液的自身抗體一般含量較低,只檢測(cè)腦脊液樣品有假陰性的風(fēng)險(xiǎn),像10%的LGI1抗體腦炎患者僅能在血清中檢測(cè)到LGI1抗體[36]。因此對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)自免病,為獲得盡可能高的檢測(cè)靈敏度及特異度,推薦同時(shí)檢測(cè)血清及腦脊液樣品。

檢測(cè)流程上一般推薦使用TBA篩查神經(jīng)系統(tǒng)自身抗體信號(hào),同時(shí)使用抗原明確的CBA或免疫斑點(diǎn)法對(duì)部分已知自身抗體進(jìn)行篩查[1, 2]。一般實(shí)驗(yàn)室會(huì)根據(jù)對(duì)各種方法的熟悉程度,試劑獲取及操作便利性,采用不同的檢測(cè)流程,比如只進(jìn)行CBA/免疫斑點(diǎn)檢測(cè);先進(jìn)行CBA/免疫斑點(diǎn)檢測(cè),對(duì)陽性樣品再使用TBA進(jìn)行驗(yàn)證[38];先進(jìn)行TBA篩查再使用CBA/免疫斑點(diǎn)確定抗體[33]等。在長(zhǎng)期的檢測(cè)工作中,這些不同的流程會(huì)分別帶來不同的效果:較高的時(shí)效性但較低的檢測(cè)準(zhǔn)確度(僅CBA/免疫斑點(diǎn));已知抗體檢測(cè)準(zhǔn)確度較高(先CBA/免疫斑點(diǎn),陽性樣品使用TBA驗(yàn)證)但會(huì)有大量樣品的檢測(cè)結(jié)果為陰性;大量的陽性檢測(cè)結(jié)果(先TBA)但已知抗體檢測(cè)為陰性(后CBA/免疫斑點(diǎn))。無論采取何種流程,總有一定比例的樣品檢測(cè)結(jié)果使診斷變得比較困難。對(duì)每一例樣品同時(shí)使用TBA和CBA/免疫斑點(diǎn)檢測(cè),并且在使用CBA/免疫斑點(diǎn)檢測(cè)時(shí),盡量全范圍的涵蓋已知自身抗體,這個(gè)理想的做法在流程上是完備的,不過實(shí)際工作中因時(shí)效性和檢測(cè)成本的限制使之難以實(shí)現(xiàn)。TBA及CBA/免疫斑點(diǎn)檢測(cè)試劑盡可能的商業(yè)化且生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化,開發(fā)涵蓋已知自身抗體的高通量CBA/免疫斑點(diǎn)檢測(cè)試劑,以及實(shí)驗(yàn)操作和結(jié)果判斷自動(dòng)化,使各個(gè)環(huán)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)一致,才可能從技術(shù)根本上解決這個(gè)困境。

4 抗體的滴度

CBA或TBA實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)抗體滴度值來反映抗體濃度,對(duì)一個(gè)樣品進(jìn)行連貫梯度稀釋并做CBA/TBA染色,陽性信號(hào)會(huì)依次減弱,選出能夠觀察到陽性信號(hào)的最大稀釋倍數(shù)稱為該樣品的滴度值。

正常人可能帶有一些低滴度的自身抗體,比如GAD65抗體可在8%的正常人體內(nèi)檢出,一些患者體內(nèi)的低滴度GAD65抗體可能和其它系統(tǒng)性自身免疫病或1型糖尿病有關(guān),通常不會(huì)表現(xiàn)出神經(jīng)精神癥狀。抗體滴度高低是否可以反映病情輕重、進(jìn)展?fàn)顩r以及治療預(yù)后,目前還缺少足夠的研究來證實(shí)。整體而言,自身抗體水平與病情危重程度的相關(guān)性比較弱。神經(jīng)系統(tǒng)抗胞內(nèi)抗體不能直接接觸抗原,一般認(rèn)為不具有直接致病性,高滴度并不一定會(huì)比低滴度更具有診斷特異性,在判斷治療是否有效及預(yù)后評(píng)估上,監(jiān)控抗體的滴度意義也并不明顯。抗表面抗體因?yàn)橛兄苯又虏〉目赡?一些研究認(rèn)為滴度變化可用來評(píng)估治療效果和預(yù)后,像高滴度的NMDAR抗體可預(yù)示較差的結(jié)局,患者治愈后繼續(xù)監(jiān)控腦脊液NMDAR抗體一定程度上可預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)的情況[39]。不過治愈后定期抽取腦脊液這一侵入性操作是否必需,還需要更強(qiáng)的研究數(shù)據(jù)來支持這一觀點(diǎn)。在MOG抗體陽性的ADEM患者中也有類似發(fā)現(xiàn),持續(xù)的血清檢測(cè)陽性者88%會(huì)復(fù)發(fā)[40]。

5 臨床診斷采用的抗體譜

傳統(tǒng)的抗體譜篩查策略對(duì)近十余年來大量新發(fā)現(xiàn)的自身抗體應(yīng)對(duì)不暇。這些新發(fā)現(xiàn)的自身抗體多是以個(gè)案報(bào)道的形式公布的,加上神經(jīng)系統(tǒng)自免病的罕見和復(fù)雜性,若要明確某個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)自免病特異的抗體譜,往往需要一個(gè)漫長(zhǎng)的時(shí)期和一系列的研究證明。比如AE已有幾十年的研究歷史,期間有大量的自身抗體被報(bào)道與之有關(guān),但經(jīng)過系統(tǒng)研究認(rèn)為特異性足夠好的自身抗體只有十余種[41],像NMDAR(腦脊液檢出),LGI1,CASPR2(血清高滴度),AMPAR,GABABR,DPPX,GAD,Hu,Ma2,CV2,Amphiphysin,Tr。臨床醫(yī)師在對(duì)某些特定狀況的疑似患者診斷時(shí),會(huì)困惑于選擇哪種或哪些抗體進(jìn)行篩查,直接采用大范圍抗體譜進(jìn)行篩查往往在時(shí)間及成本上難以實(shí)現(xiàn)。隊(duì)列研究對(duì)幾十或幾百例特定疾病狀態(tài)患者進(jìn)行抗體篩查并檢出若干抗體,相對(duì)于個(gè)案報(bào)道來說,可提供較為系統(tǒng)的篩查方案以供參考。下面列舉一部分經(jīng)隊(duì)列研究及綜述分析的抗體譜。①免疫檢查點(diǎn)(CTLA-4, PD-1, PDL-1)抑制劑治療腫瘤出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)自免性癥狀(ICIs)[42, 43]:有中樞癥狀的可檢出Hu,CV2,amphiphysin,GFAP,NIF,Zic4,PDE10A,SOX1,LGI1,GAD65,NMDAR,GABABR,抗體,及低滴度的抗VGKC,P/Q型及 N型VGCC抗體;有外周神經(jīng)癥狀(包括MG或肌病)的可檢出CNTN2,AchR,RyR,LRP4,Titin,Kv1.4,神經(jīng)節(jié)甘脂GM1/2和GalNAc-GD1a,氨酰tRNA合成酶,TIFg,橫紋肌抗體。這些抗體中有一些可能是腫瘤本身產(chǎn)生的,與因藥物產(chǎn)生的無法區(qū)分。ICIs的發(fā)生情況和臨床表現(xiàn)非常復(fù)雜,不同研究中在ICIs檢出抗神經(jīng)抗體的概率差別比較大,可以從低到高至54%[42]。②小細(xì)胞肺癌伴有神經(jīng)系統(tǒng)副腫瘤綜合征[44]:Hu,Ri,Zic4,CV2,MAP1B,P/Q型及N型VGCC,GAD65,SOX1,AchR, gAchR,GABABR,AMPAR,GlyR,DACH1(ANNA3),及橫紋肌抗體。③胸腺瘤伴有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[45]:AQP4,AMPAR,GABAAR,GlyR,NMDAR,LGI1,Caspr2,VGKC,AchR,gAChR,CV2抗體。④中樞神經(jīng)系統(tǒng)皰疹病毒感染伴有自免腦炎[46]:NMDAR,GABABR,GABAAR,AMPAR抗體。⑤新冠病毒(COVID-19)感染伴有神經(jīng)精神癥狀[9, 47, 48]:Yo,Hu,Ma,Titin,ARHGAP31,GAD65,GFAP,AchR,D2R,MOG,NMDAR,CASPR2,MCTP1,myelin,甘脂GD1a抗體。⑥局灶性癲癇伴有輕度腦炎癥狀[49, 50]:LGI1,CASPR2,NMDAR,GABABR,GABAAR,Contactin-2,GlyR,AMPAR,GAD抗體。

由于神經(jīng)系統(tǒng)自免病頗為罕見,只有少數(shù)的醫(yī)學(xué)中心或者專業(yè)實(shí)驗(yàn)室有機(jī)會(huì)進(jìn)行隊(duì)列研究,這類文獻(xiàn)發(fā)表較少。并且相對(duì)于新自身抗體報(bào)道的較高頻率,商業(yè)化檢測(cè)試劑種類更新明顯滯后,實(shí)驗(yàn)室自建方法時(shí)也需要考慮到人工成本及技術(shù)熟悉程度,因此多數(shù)隊(duì)列研究選取的往往不是覆蓋比較全面的,而是范圍較窄的“傳統(tǒng)”抗體譜進(jìn)行篩查。這種情況下若要總結(jié)出比較全面的抗體譜篩查方案,就需要若干研究共同積累足夠數(shù)據(jù),往往需要一個(gè)相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。

在這個(gè)抗體檢測(cè)方案完善的過程中,臨床遇到自免病懷疑指數(shù)很高的患者,使用某個(gè)抗體譜篩查為陰,甚至TBA檢測(cè)也無明顯的抗體信號(hào),這種情況臨床上并不罕見。目前認(rèn)為抗體陽性數(shù)據(jù)的缺失并不能排除神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫病的診斷,臨床需要綜合考慮患者信息給以判斷。同時(shí)實(shí)驗(yàn)室對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行改進(jìn),在能力時(shí)效及成本允許范圍內(nèi)適當(dāng)擴(kuò)大抗體譜篩查范圍,以及對(duì)樣品進(jìn)行新自身抗體的尋找鑒定是更妥當(dāng)?shù)淖龇ā?/p>

6 小結(jié)

現(xiàn)在雖然有多種神經(jīng)系統(tǒng)自身抗體的檢測(cè)方法,但由于每種方法都已發(fā)現(xiàn)有技術(shù)上的局限,加上神經(jīng)系統(tǒng)免疫性疾病的復(fù)雜性及罕見性,目前的臨床數(shù)據(jù)并不足以支持以某方法抗體檢測(cè)結(jié)果作為疾病診斷金標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)論。估計(jì)在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi),對(duì)這類疾病的診斷仍需要多個(gè)指標(biāo)同時(shí)考慮:癥狀、抗體、影像病理或其他特殊檢測(cè)結(jié)果、病因/前驅(qū)疾病及病情發(fā)展情況,以及對(duì)一些治療措施的反應(yīng)。這樣才能更準(zhǔn)確地對(duì)患者狀況、療法選擇及預(yù)后進(jìn)行評(píng)估。

近些年來隨著研究進(jìn)展,抗體在臨床診斷中越來越重要,抗體檢測(cè)的精細(xì)及便利程度變化極大影響著臨床上對(duì)疾病的理解和應(yīng)對(duì),專家共識(shí)中對(duì)癥狀、抗體等幾個(gè)指標(biāo)的解釋及應(yīng)用越來越精確翔實(shí)。可以預(yù)想未來標(biāo)準(zhǔn)化的高通量自動(dòng)化檢測(cè)方法將減少分歧,利于臨床數(shù)據(jù)的迅速積累;新的自身抗體持續(xù)發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用,填補(bǔ)臨床解釋中的模糊之處;進(jìn)而更有臨床意義的抗體從眾多抗體報(bào)道中被挑選出來,可以更具針對(duì)性地對(duì)致病機(jī)制和治療方案進(jìn)行研究。這些抗體靶點(diǎn)具體而且特異,將會(huì)使神經(jīng)系統(tǒng)自免病為抗原特異性療法的完美模型。