腐乳中菌群基因組DNA提取方法的對比研究

張娜娜，徐 瓊，黎鴻藝

（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海 200233）

發(fā)酵作為一種傳統(tǒng)的食品儲(chǔ)存方式，其過程在過去是難以控制的，這是因?yàn)槲⑸锵到y(tǒng)極其復(fù)雜，含有大量的有益微生物和有害微生物[1]。作為我國具有民族特色的傳統(tǒng)大豆發(fā)酵即食產(chǎn)品，腐乳被稱為“東方奶酪”，具有很好的保健功能[2-5]。傳統(tǒng)的腐乳在發(fā)酵過程中主要采用開放式發(fā)酵工藝，需要人工進(jìn)行手工操作的環(huán)節(jié)較多，主要工序包括前發(fā)酵、腌坯、后發(fā)酵、裝瓶、儲(chǔ)存、運(yùn)輸?shù)龋谶@眾多工序中，可能會(huì)有細(xì)菌、酵母、霉菌等微生物對腐乳造成污染，其中微好氧菌、兼性厭氧菌和專性厭氧菌在促進(jìn)產(chǎn)品成熟、改變風(fēng)味和口感的同時(shí)也會(huì)帶來一定的污染，這會(huì)導(dǎo)致食源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加[6-9]。因此，微生物多樣性研究對腐乳特征質(zhì)量指標(biāo)具有重要意義。

腐乳屬于高鹽發(fā)酵產(chǎn)品，其含有的多種微生物屬于耐高鹽微生物，目前很多微生物無法通過培養(yǎng)的方式獲得[10]。另外，腐乳中含有大量的大豆蛋白質(zhì)、大豆脂肪和大豆基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）等物質(zhì)，這些物質(zhì)也增加了腐乳中微生物的基因組DNA提取的難度。分子生物學(xué)因具有高度特異性，被廣泛應(yīng)用于食品微生物的研究。分子生物學(xué)技術(shù)不需要分離培養(yǎng)，而是通過分析微生物基因序列，對食品發(fā)酵過程中微生物的多樣性和功能性進(jìn)行更全面和客觀的研究，同時(shí)能快速分析發(fā)酵過程中微生物群落的變化。近年來，基于細(xì)菌16S rRNA及真菌ITS區(qū)域擴(kuò)增的測序技術(shù)已成為發(fā)酵產(chǎn)品微生物學(xué)研究的主要方法之一[11-12]。譚強(qiáng)來等[13]借助高通量測序分析了江西特色發(fā)酵豆豉中微生物的多樣性；趙恒等[14]通過對不同地區(qū)花色腐乳真菌多樣性進(jìn)行分析比較得出，產(chǎn)地和工藝對豆腐中的細(xì)菌有明顯影響；黃鄭朝等[15]在對中國不同區(qū)域的發(fā)酵香腸進(jìn)行細(xì)菌多樣性研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，我國不同地區(qū)發(fā)酵香腸的細(xì)菌多樣性存在差異，其中四川地區(qū)和哈爾濱地區(qū)的細(xì)菌多樣性高于其他地區(qū)；劉怡萱等[16]借助高通量測序技術(shù)對西藏農(nóng)、牧區(qū)牦牛酸奶菌群多樣性進(jìn)行了分析；武亞婷等[17]對新疆自然發(fā)酵辣椒醬中微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行了分析；寧亞麗等[18]通過高通量測序技術(shù)分別對吉林延邊朝鮮族地區(qū)的酒曲及其發(fā)酵后粗濾和精濾米酒中的細(xì)菌和真菌菌群進(jìn)行了分析。

目前，針對腐乳中存在的大量真菌與細(xì)菌，學(xué)者們致力于研究開發(fā)復(fù)雜基質(zhì)中菌種基因組DNA抽提技術(shù)，并試圖借助前沿的分子生物學(xué)技術(shù)找到一種快速、獲得率高且不影響擴(kuò)增效果的基因組DNA提取方法[19-23]。同時(shí)，通過對我國市場上目前有販?zhǔn)鄣母檫M(jìn)行菌群研究，了解其中有益菌和有害菌的種類及分布，為更加有效地分析發(fā)酵食品的微生物多樣性提供依據(jù)[24-25]。目前，借助高通量測序?qū)Πl(fā)酵食品進(jìn)行菌群分析的方法正在快速發(fā)展，但仍然不夠成熟。例如該技術(shù)在樣本的采集、保存，基因組DNA提取、擴(kuò)增的引物、測序平臺(tái)的選擇上仍然存在不足，這可能會(huì)直接導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果無法有效反映微生物的多樣性。為更好研究腐乳中微生物菌群的多樣性，本實(shí)驗(yàn)在樣品前處理時(shí)通過低速和高速離心相結(jié)合的方式降低樣品中含有的高鹽、高糖成分及豆制品，從而降低了大豆基因組DNA的存在，同時(shí)重復(fù)離心、提取，并按比例加入有機(jī)試劑苯酚、氯仿、異丙醇等，降低了蛋白質(zhì)、脂類的含量，保證了試驗(yàn)有序進(jìn)行。在排除其他影響因素的情況下，本研究以非培養(yǎng)方式對腐乳中的微生物進(jìn)行了基因組DNA提取，對比改良十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法與玻璃珠法的提取效率與提取效果，分析了樣品全基因提取的不同方法對高通量測序的影響，并結(jié)合檢測結(jié)果，分析腐乳中的菌落結(jié)構(gòu)，最終對兩種基因組DNA提取方法進(jìn)行比較分析，為快速、準(zhǔn)確的建立非培養(yǎng)方式提取腐乳中基因組DNA奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅腐乳（LA5）、白腐乳（LA6）樣品：市售；玻璃珠試劑盒：天根生物技術(shù)有限公司；CTAB：實(shí)驗(yàn)室自制；蛋白酶K（＞30 U/mg）、溶菌酶（≥20 000 U/mg）：美國Promega公司；Tris飽和酚（分析純）：生工（上海）股份有限公司；三氯甲烷、異戊醇、無水乙醇（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Premix ExTaqMix：日本寶生物公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

5430R振蕩水浴槽：德國艾本德有限公司；5810R臺(tái)式離心機(jī)：美國Eppendorf公司；DS-11微量紫外分析儀：美國丹諾爾公司；ESCO LA2-4A1生物安全柜：新加坡藝思高科技有限公司；VERITI梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；Sub-Cell電泳儀、Geldoc XR＋型凝膠成像儀：美國Bio-Rad公司；MiSeq高通量測序平臺(tái)：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 腐乳樣品前處理

取適量樣品于無菌袋中混勻，取40 mL混勻液于50 mL離心管中，2 000×g離心5 min，將上清液全部移至新的50 mL離心管中，9 000×g離心5 min；去上清，沉淀中加入25 mL無菌水，振蕩混勻，再次9 000×g離心10 min；去上清，沉淀中加入20 mL無菌水，渦旋振蕩混勻，備用。

1.3.2 玻璃珠法提取基因組DNA

取1.8 mL混勻液，按照玻璃珠試劑盒說明書對樣品中微生物菌群的基因組DNA進(jìn)行提取。

1.3.3 改良CTAB法提取基因組DNA

取5 mL混勻液至離心管中，9 000×g離心10 min，去上清，在沉淀物中加入10mL無菌水，混勻，9000×g離心10 min，去上清，得到的沉淀中加入溶菌酶（10 mg/mL）800 μL，37 ℃水浴1 h，加入蛋白酶K 40 μL、CTAB裂解液800 μL，再次水浴（56 ℃，2 h）。參考徐瓊等[26]的方法提取基因組DNA。

1.3.4 測定方法

采用DS-11微量紫外分析儀測定提取的基因組DNA濃度、A260nm值/A280nm值以及A230nm值/A280nm值；為驗(yàn)證其比值對PCR擴(kuò)增的影響，分別以兩種方法提取得到的基因組DNA為模板，采用細(xì)菌16S rDNA區(qū)域引物16SF（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1495R（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性45 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增體系：Premix ExTaqMix 10 μL，上、下游引物（5 μmol/L）各1 μL，DNA模板2 μL，去離子水補(bǔ)足至20 μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，對比擴(kuò)增條帶的亮度及純度。

1.3.5 高通量測序

以提取的總基因組DNA為模板，以細(xì)菌16S rRNA基因V1～V3區(qū)合成引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）、534R（5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'）和真菌ITS1區(qū)域擴(kuò)增引物ITS 1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAGTAA-3'）；ITS 1R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件及參數(shù)參照文獻(xiàn)[26-27]。純化回收擴(kuò)增產(chǎn)物，采用Illumina MiSeq高通量測序平臺(tái)進(jìn)行測序及生物信息學(xué)分析。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

使用軟件FastQC（http：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc）對高通量測序得到的雙端序列數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，使用軟件Cutadapt（http：//code.google.com/p/cutadapt/）去除原始數(shù)據(jù)的接頭，使用軟件FLASH（https：//sourceforge.net/projects/flashpage/files/）連接兩端數(shù)據(jù)，使用軟件QIIME2[28]篩選序列和嵌合體，并使用Usearch[29]算法去除嵌合體，參數(shù)默認(rèn)。使用軟件QIIME2在97%相似度下進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類。使用軟件QIIME2進(jìn)行Alpha多樣性（Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)）和β多樣性分析，比較不同樣品的微生物群落構(gòu)成。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種方法提取基因組DNA質(zhì)量的比較

以紅腐乳和白腐乳作為實(shí)驗(yàn)樣本，采用玻璃珠法和改良CTAB法提取得到的基因組DNA質(zhì)量見表1。由表1可知，改良CTAB法提取得到的基因組DNA質(zhì)量濃度（＞200 ng/μL）遠(yuǎn)高于玻璃珠法提取得到的基因組DNA質(zhì)量濃度（＜5ng/μL），因此，玻璃珠法無法再次進(jìn)行核酸純化，且無法一次性進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)。用于PCR擴(kuò)增的DNA最佳A260nm值/A280nm值在1.8～2.0之間，兩種方法提取得到的基因組DNA的A260nm值/A280nm值均在此范圍；改良CTAB法提取得到的基因組DNA的A260nm值/A230nm值（0.71～0.79）相較于玻璃珠法提取得到的DNAA260nm值/A230nm值（1.28～1.49）較差，說明改良CTAB法較玻璃珠法提取得到的DNA中蛋白含量較高，純化蛋白能力較差。

為更加直觀地觀察改良CTAB法和玻璃珠法提取得到的基因組DNA對PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響，現(xiàn)對兩種方法提取得到的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖1。由圖1可知，以兩種方法提取得到的基因組DNA為模板均PCR擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶，玻璃珠法PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶比改良CTAB法PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶更亮，但拖帶情況相對嚴(yán)重，說明玻璃珠法提取得到的基因組DNA相較于CTAB法提取得到的基因組DNA雜質(zhì)更多。通過基因組DNA提取濃度結(jié)果和PCR擴(kuò)增結(jié)果來看，改良CTAB法提取得到的DNA濃度比玻璃珠法提取得到的DNA濃度更高，質(zhì)量更好，更適合進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2.2 兩種DNA提取方法下不同腐乳樣品微生物菌群多樣性分析

2.2.1 Alpha多樣性分析

不同腐乳樣本的Alpha多樣性分析結(jié)果見表2。由表2可知，各樣本的覆蓋率均＞0.9，表明樣本庫中的序列大多被檢測到，結(jié)果可以反映實(shí)際樣本情況。對于紅腐乳和白腐乳而言，玻璃珠法和改良CTAB法兩種方法得到的細(xì)菌和真菌菌群的Alpha多樣性相差較小，說明在不同腐乳樣本中兩種基因組DNA提取方法均實(shí)用。

表2 不同腐乳樣品Alpha多樣性分析結(jié)果Table 2 Alpha diversity analysis results of different sufu samples

2.2.2 微生物菌群結(jié)構(gòu)分析

（1）細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析

基于門水平和屬水平對不同腐乳樣品細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2。由圖2a可知，在門分類水平上，樣品LA5經(jīng)兩種提取方法得到的基因組DNA均鑒定到4個(gè)優(yōu)勢細(xì)菌門（相對豐度＞1%），樣品LA6經(jīng)兩種提取方法得到的基因組DNA均鑒定到3個(gè)優(yōu)勢細(xì)菌門。其中厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Proteobacteria）在樣品LA5和樣品LA6中的相對豐度之和均＞95%。從相對豐度來看，玻璃珠法得到的厚壁菌門（Firmicutes）（LA5：57.81%；LA6：97.10%）較改良CTAB法得到的厚壁菌門（Firmicutes）（LA5：45.32%；LA6：95.76%）高，但玻璃珠法得到的擬桿菌門（Bacteroidetes）（LA5：9.12%）、變形菌門（Proteobacteria）（LA5：28.47%；LA6：1.53%）較改良CTAB法得到的擬桿菌門（Bacteroidetes）（LA5：20.20%）、變形菌門（Proteobacteria）（LA5：31.04%；LA6：2.13%）低。

圖2 基于門（a）和屬（b）水平腐乳樣品細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig.2 Analysis results of bacterial community structure based on phylum (a) and genus (b) levels

由圖2b可知，在屬分類水平上，樣品LA5經(jīng)兩種提取方法得到的基因組DNA均鑒定到20個(gè)優(yōu)勢細(xì)菌屬，樣品LA6經(jīng)兩種提取方法得到的基因組DNA均鑒定到10個(gè)優(yōu)勢細(xì)菌屬。在相對豐度＞5%的優(yōu)勢細(xì)菌屬中，樣品LA5中玻璃珠法的乳球菌屬（Lactococcus）（20.24%）、叢毛單胞菌屬（Comamonas）（15.29%）、水原拉梅爾芽胞桿菌（Rummeliibacillus）（6.31%）的相對豐度高于改良CTAB法（8.67%、9.44%、2.25%），改良CTAB法的明串珠菌屬（Leuconostoc）（12.52%）、法氏沃氏菌（Wautersiella）（15.18%）的相對豐度高于玻璃珠法（8.66%、6.48%）；樣品LA6中玻璃珠法的四鏈球菌屬（Tetragenococcus）（51.24%）、乳酸菌屬（Lactobacillus）（9.22%）的相對豐度高于改良CTAB法（41.95%、4.16%），改良CTAB法的明串珠菌屬（Leuconostoc）（12.37%）、鏈球菌屬（Streptococcus）（15.70%）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）（8.13%）的相對豐度高于玻璃珠法（5.28%、14.48%、5.79%）。

綜上，兩種基因組DNA提取方法的高通量測序結(jié)果分析得到的細(xì)菌門和屬種類相差不大。但根據(jù)革蘭氏分類可以看出，玻璃珠法更適用于革蘭氏陽性菌的基因組DNA提取，而改良CTAB法則適用革蘭氏陰性菌的基因組DNA提取。

（2）真菌菌群結(jié)構(gòu)分析

腐乳中除大量細(xì)菌外還有一定量的真菌存在，基于真菌門和屬水平對不同腐乳樣品真菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果見圖3。由圖3a可知，在門分類水平上，樣品LA5和樣品LA6經(jīng)兩種提取方法得到的基因組DNA均鑒定到2個(gè)優(yōu)勢真菌門，且玻璃珠法和改良CTAB法得到的真菌門相對豐度相差不大。

由圖3b可知，在屬分類水平上，樣品LA5經(jīng)兩種提取方法得到的基因組DNA均鑒定到5個(gè)優(yōu)勢真菌屬，樣品LA6經(jīng)兩種提取方法得到的基因組DNA均鑒定到7個(gè)優(yōu)勢真菌屬。在相對豐度＞5%的優(yōu)勢真菌屬中，樣品LA5中玻璃珠法的隱球菌屬（Cryptococcus）（19.71%）、瑟氏哈薩克斯坦酵母（Kazachstania）（6.18%）的相對豐度高于改良CTAB法（18.14%、5.65%）；樣品LA6中玻璃珠法的紅曲霉屬（Monascus）（30.48%）、曲霉屬（Aspergillus）（7.18%）的相對豐度高于改良CTAB法（26.94%、5.89%），而改良CTAB法的隱球菌屬（Cryptococcus）（42.43%）的相對豐度高于玻璃珠法（39.00%）。

綜上，兩種基因組DNA提取方法的高通量測序結(jié)果分析得到的真菌門和屬種類相差不大，說明兩種提取方法均可用于腐乳中真菌菌落的基因組DNA提取，且對真菌的提取效率影響甚微。

3 結(jié)論

在基因組DNA提取方面，改良CTAB法得到的基因組DNA濃度高于玻璃珠法。借助PCR進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，以玻璃珠法提取得到的基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增得到的條帶拖尾較改良CTAB法嚴(yán)重，說明其含有一定量的雜質(zhì)，玻璃珠法提取基因組DNA得到的基因組DNA濃度低，無法再次進(jìn)行純化，且受試劑盒中試劑的影響，無法一次性進(jìn)行大批量的基因組DNA提取。在微生物菌群多樣性和結(jié)構(gòu)方面，通過高通量測序發(fā)現(xiàn)，兩種基因組DNA提取方法均能有效提取到樣品中的微生物基因，微生物菌群Alpha多樣性相差不大，不同樣品的兩種基因組DNA提取方法得到的各微生物菌群的相對豐度存在一定差異，玻璃珠法更適用于革蘭氏陽性菌的基因組DNA提取，改良CTAB法則適用于革蘭氏陰性菌的基因組DNA提取，但微生物菌群的種類差異很小，證明兩種基因組DNA提取方式對微生物基因組DNA的提取對高通量測序結(jié)果影響甚微。綜上，玻璃珠法和改良CTAB法提取的基因組DNA均可用于腐乳中非培養(yǎng)方式的基因組DNA提取，但改良CTAB法具有更大的優(yōu)勢。