橄欖果酒發酵工藝優化與揮發性風味物質分析

王 宏，黃炳旗，劉功良，肖更生，趙文紅，李學莉，白衛東*

（1.仲愷農業工程學院 輕工食品學院 廣東省嶺南特色食品科學與技術重點實驗室 現代農業工程創新研究院，廣東 廣州 510225；2.東鵬飲料（集團）股份有限公司，廣東 深圳 518055）

橄欖（Canarium album），又稱青果，是橄欖科橄欖屬植物，主要分布在廣東、福建、廣西等省，具有悠久的食用和藥用歷史。橄欖富含多酚、類黃酮、膳食纖維、礦物質等營養成分，具有抗氧化[1]、抗神經炎癥[2]、調節腸道微生物[3]、防止肥胖癥[4]等多種生物活性，逐漸受到食品、醫藥和保健行業的重視，已被我國衛生健康委員會列入藥食同源目錄[5]。目前，橄欖產業存在科技創新不足、采后商品化和深加工滯后、市場開發不足、品牌建設乏力等問題[6]，不利于橄欖產業的精深加工開發和全面發展。使用有效的加工技術和方法對橄欖進行加工，在保留橄欖果的營養價值的同時，又能改善產品的功能特性，提升橄欖的加工利用價值，是橄欖加工產業的新熱點。

橄欖除了鮮食之外，還可制作成果汁飲料[7-8]、果醋[9]、果酒[10-11]等形式在市場進行銷售。其中，果酒可以極大地保留果實中原有的營養物質，具有多種生理活性[12]。因此，利用橄欖果實通過發酵生產橄欖果酒，不僅能有效保留果實中原有的營養物質[13]，而且豐富并增加了其他營養成分及保健功能[14]。對橄欖果酒發酵工藝進行優化，極大地保留橄欖中的多酚類物質、維生素C等生物活性成分[15-18]，同時對其特征成分和風味進行分析，開發一款符合大眾口味的低醇度高營養價值的橄欖果酒，一方面可以為橄欖果酒的研究提供理論基礎，另一方面可以為橄欖果酒的加工生產及應用提供新的指導方向。

本研究以橄欖果為原料，研制橄欖發酵型果酒。首先篩選出橄欖果酒最適發酵菌種，再通過單因素和正交試驗對橄欖果酒的工藝進行優化，并對最優工藝下的橄欖果酒中多酚、維生素C、揮發性風味物質等特征成分進行分析，以期為橄欖果酒的開發與利用提供理論參考，也為橄欖果酒的產業化發展提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橄欖果（廣東檀香1號）：購自潮州市文祠鎮；食用小蘇打、白砂糖：市售；EX-V果膠酶（活性和廣譜邊緣酶活性）、DV10酵母：法國拉曼集團；SY酵母、BA酵母、RV171酵母、BV818酵母：安琪酵母股份有限公司；偏重亞硫酸鉀、氫氧化鈉標準滴定溶液、酚酞指示液（10 g/L）、福林酚、沒食子酸標準品、抗壞血酸標準品、二氯靛酚、葡萄糖（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸、氯化鈉、碳酸氫鈉（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

HH-6同步攪拌水浴鍋：上海赫田科學儀器有限公司；BSP生化培養箱：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；ZQZY-98CES培養箱：上海知楚儀器有限公司；P901酸度計：上海佑科儀器儀表有限公司；SOP電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；LB50T糖度計：廣州速為電子科技有限公司；5977B-8890氣相色譜-質譜聯用（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）儀：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 橄欖果酒發酵工藝流程及操作要點

橄欖果挑選→橄欖前處理（洗滌、去核、破碎）→調整成分→菌種活化→控溫發酵→滅菌→過濾→橄欖果酒

橄欖果挑選：挑選表皮完整、無破損、呈鮮綠或者淡綠色的橄欖果。

橄欖前處理：將橄欖洗凈放入容器內，按照一定的料液比添加水，將橄欖破碎到一定程度后，迅速轉移至250 mL錐形瓶中。

調整成分：分別加入橄欖與水總質量（或果漿總質量）0.02%的C-MAX果膠酶和0.02%的偏重亞硫酸鉀，使用白砂糖調整發酵液糖度為33°Bx，充分攪拌，使用小蘇打將待發酵液初始pH調節至4.5。

菌種活化、控溫發酵：將DV10酵母和水按照比例1∶10（g∶mL）進行混合，37 ℃活化15 min。再按照一定接種量接種到橄欖果漿中，使用封口膜進行密封，放入恒溫培養箱中在一定溫度條件下進行發酵，使用糖度計對糖度變化進行監測，待橄欖果酒中糖度不再下降時，即認為橄欖果酒發酵結束。

滅菌、過濾：將發酵好的橄欖果酒75 ℃滅菌5 min，把滅菌好的橄欖果酒使用3～4層121 ℃滅菌15 min后的紗布過濾，收集濾液至錐形瓶中，使用封口膜進行密封，4 ℃冰箱中冷藏。

1.3.2 最優菌種的篩選

選取BV818、SY、DV10 3種酵母作為考察菌種，控制橄欖果破碎程度為90%，料液比為1∶4（g∶mL），3種酵母添加量為0.05%，發酵液糖度為33°Bx，發酵溫度24 ℃。通過基礎工藝條件制作橄欖果酒，并記錄發酵過程中的糖度變化、酒精度和感官評分。

1.3.3 橄欖果酒發酵工藝優化單因素試驗

設定橄欖果破碎程度為90%，料液比為1∶4（g∶mL），發酵溫度24 ℃為基礎條件，改變單一條件，以橄欖果酒酒精度和感官評分作為評價指標，分別考察破碎程度（0、30%（顆粒大小為10 mm×5 mm）、60%（5 mm×2 mm）、90%（＜1 mm×1 mm）），料液比（1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6（g∶mL）），發酵溫度（16 ℃、20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃）對橄欖果酒發酵的影響。

1.3.4 橄欖果酒發酵工藝優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以橄欖果破碎程度（A）、料液比（B）、發酵溫度（C）為因素，以橄欖果酒酒精度和感官評分為評價指標，設計3因素3水平L9（33）正交試驗，正交試驗因素與水平見表1。

表1 橄欖果酒發酵工藝優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation process optimization of olive wine

1.3.5 測定方法

（1）感官評價

選擇10位經過培訓并具備食品專業知識的感官評價人員，從外觀、香氣、口感和典型性4個方面對橄欖果酒進行感官評分，取10人平均分，滿分為100分。感官評分標準見表2。

表2 橄欖果酒感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of olive wine

（2）理化指標測定

糖度：采用糖度計法；酒精度、總酸、還原糖、維生素C：采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酒精計法、電位滴定法、直接滴定法和2,6-二氯靛酚滴定法；總酚：采用福林酚法[19]并稍作修改，福林酚試劑添加量為1 mL，10%碳酸鈉與福林酚用量比例為3∶1，反應時間為30 min。

（3）揮發性風味物質的測定

采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜法（headspacesolid phase microextraction-gas chromatograph-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）測定橄欖果酒揮發性風味物質。將萃取針（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）于250 ℃條件下活化10min，備用。吸取7 mL發酵液于15 mL樣品瓶中，加入NaCl 1.4 g和磁力轉子，蓋上鋁蓋；然后將樣品置于磁力攪拌加熱器上，45 ℃預熱5 min；插入已活化的萃取針，吸附萃取50 min；隨即將萃取針插入GC-MS儀器進樣口中，250 ℃解吸5 min。

GC條件：采用DB-WAX UI色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。進樣口溫度250 ℃，進樣模式為不分流，以高純氦氣（He）作為載氣。柱溫箱升溫程序：起始溫度40 ℃，保持2 min；以5 ℃/min升溫至100 ℃，保持10 min；以10 ℃/min升溫至200 ℃，保持10 min。

MS 條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源；離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；采集模式為全掃描；質量掃描范圍50～550 m/z。

定性定量方法：選取匹配度≥70%的物質，通過美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）14譜庫與揮發性化合物譜圖進行比對，結合相關資料及文獻進行分析和鑒定進行定性；采用面積歸一法進行定量[20]。

1.3.6 數據分析

試驗結果以“平均值±標準差”（n=3）的形式表示。采用JMP13進行數據顯著性分析，P＜0.05表示具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 酵母菌種類型對橄欖果酒發酵的影響

酵母菌菌種類型對橄欖果酒發酵的影響見表3。由表3可知，3種酵母菌發酵制備的橄欖果酒酒精度及殘糖均符合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中規定的范圍；DV10酵母發酵制備的橄欖果酒感官評分最高（74.53分）且較另外兩種酵母發酵周期縮短，表現出最高的活性，因此后續試驗將選用DV10酵母發酵橄欖果酒。

表3 酵母菌種類型對橄欖果酒發酵的影響Table 3 Effect of yeast type on the fermentation of olive wine

2.2 橄欖果酒發酵工藝優化單因素試驗

2.2.1 破碎程度對橄欖果酒發酵的影響

由圖1可知，隨著橄欖果破碎程度的提高，橄欖果酒酒精度、感官評分均呈先上升后趨于平緩的趨勢。橄欖果破碎程度為90%時，橄欖果酒的酒精度、感官評分均最高，分別（13.43±0.47）%vol和（62.67±1.53）分。可能是因為當橄欖果為破碎程度為90%時，橄欖果肉中的風味物質更容易析出到酒體中，豐富了橄欖果酒的風味成分，從而提高了橄欖果酒的感官效果。因此選擇橄欖果的最佳破碎程度為90%。

圖1 破碎程度對橄欖果酒品質的影響Fig.1 Effect of crushing degree on the quality of olive wine

2.2.2 料液比對橄欖果酒發酵的影響

由圖2可知，隨著料液比的增加，橄欖果酒酒精度、感官評分均呈先下降后上升再下降的趨勢。當料液比為1∶4（g∶mL）時，橄欖果酒的酒精度、感官評分均達到最高，分別為（16.00±0.17）%vol、（75.60±2.31）分；在料液比為1∶2～1∶4（g∶mL）時，隨著果肉的減少，橄欖果肉本身的澀味減少，果香味趨于合適，使得果酒口感得到提升，因此感官評分呈上升趨勢；料液比在1∶4（g∶mL）之后，隨著果肉減少，橄欖果本身的特殊風味被淡化，影響橄欖果酒的整體風味，使得感官評分下降；當料液比為1∶6（g∶mL）時，感官評分呈現出一定的上升趨勢，但該料液比下的橄欖特征風味淡薄，酒香掩蓋了果香，無果酒本身的清爽口感。因此選擇最佳料液比為1∶4（g∶mL）。

圖2 料液比對橄欖果酒品質的影響Fig.2 Effect of solid and liquid ratio on the quality of olive wine

2.2.3 發酵溫度對橄欖果酒發酵的影響

由圖3可知，隨著發酵溫度的升高，橄欖果酒酒精度、感官評分均呈先上升后下降的趨勢，在發酵溫度為24 ℃時，橄欖果酒的酒精度、感官評分均達到最高，分別為（15.13±0.64）%vol、（74.53±3.72）分；在發酵溫度為16～24 ℃時，隨著發酵溫度的升高，酒精度與感官評分都與溫度呈現正相關關系，此時酵母在低溫下生長速度較慢，導致發酵不徹底，因此酒精度不高；當溫度超過24 ℃時，隨著溫度的升高，橄欖果酒的酒精度與感官評分都呈現快速下降的趨勢。綜上，認為發酵溫度對橄欖果酒的發酵品質具有較大的影響，最佳發酵溫度為24 ℃。

2.3 橄欖果酒發酵工藝優化正交試驗

由表4可知，在3種影響橄欖果酒發酵的因素中，按照各因素對感官評分的影響，從大到小依次是破碎程度（A）＞發酵溫度（C）＞料液比（B）。通過計算K值，可知最優發酵工藝組合為A3B1C3，即橄欖果酒最優工藝參數為破碎程度為90%、料液比為1∶3（g∶mL）、發酵溫度為28 ℃。

2.4 驗證試驗及果酒品質分析

為驗證所得結果的正確性，在最優工藝參數組合下進行3次重復試驗。結果表明，在最優工藝下釀造的橄欖果酒感官評分為（91.83±0.67）分，具有較濃郁的橄欖果香與酒香，色澤金黃，清亮透明，口感圓潤醇厚、回味綿延。經測定，橄欖果酒酒精度為（15.03±0.4）%vol，總酚含量為（27.76±0.36）g/L，總酸含量為（5.00±0.13）g/L，還原糖含量為（2.53±0.09）g/L，維生素C含量為（30.49±3.10）mg/L，符合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》要求。

2.5 橄欖果酒揮發性風味物質分析

通過HS-SPME-GC-MS測定橄欖果酒中揮發性風味物質，結果見表5。由表5可知，從橄欖果酒中共檢測出38種揮發性物質，包括9種醇類，相對含量為46.48%；酯類13種，相對含量為4.01%；醛類5種，相對含量為1.79%；酮類1種，相對含量為0.11%；酸類2種，相對含量為0.57%；酚類2種，相對含量為2.06%；烴類1種，相對含量為0.18%；烯烴類3種，相對含量為0.13%；萜烯1種，相對含量為0.32%；其他類型揮發性風味物質1種，相對含量為0.15%。其中，橄欖果酒中主要的揮發性風味物質為醇類和酯類，共同構成橄欖果酒特殊風味的基礎[21-23]。

表5 橄欖果酒揮發性風味物質檢測結果Table 5 Determination results of volatile flavor components in olive wine

醇類物質為橄欖果酒中含量最高的揮發性風味物質。這些醇類物質可賦予橄欖果酒不同的香味，如苯乙醇能賦予橄欖果酒清甜的玫瑰花香、蜂蜜味與薔薇花香，能賦予橄欖果酒獨特的香氣，對酒的香氣形成具有積極作用[24-25]；異戊醇微甜帶苦，能賦予橄欖果酒獨特的苦杏仁味[26]；辛醇能賦予果酒茉莉與檸檬的香味[27]。各種高級醇相互協調，使得橄欖果酒的口感更加豐滿，豐富了橄欖果酒的酒香。

酯類物質為橄欖果酒中種類最豐富的揮發性風味物質，這類物質既呈香又呈味，是橄欖果酒中重要的揮發性風味物質。本研究共檢測出13種酯類物質，其中，乙酸乙酯的濃度最高，其次是辛酸乙酯。這些酯類物質可賦予果酒不同香味，如辛酸乙酯可賦予橄欖果酒令人愉快的花果香氣及白蘭地酒香氣[28]；癸酸乙酯可賦予果酒李子花香和果香[29]。各種酯類物質的香味相互協調、融合，豐富了橄欖果酒的風味。

醛類、酚類、酮類和酸類物質在橄欖果酒中的含量較少。其中，苯甲醛可賦予橄欖果酒櫻桃與堅果香，這種物質也同樣存在于白蘭地中，是重要的香氣物質[30]；辛酸可賦予橄欖果酒草莓味、桃子味等多種果味。這些物質對于橄欖果酒風味的形成具有促進作用，豐富了橄欖果酒整體的風味。

3 結論

本研究以橄欖鮮果為原料，對橄欖果酒的工藝、品質及風味進行探究，分析了酵母菌種、破碎程度、發酵溫度及料液比對橄欖果酒的影響，通過正交試驗得到橄欖果酒最佳發酵工藝條件為破碎程度90%、料液比為1∶3（g∶mL）、發酵溫度為28 ℃。在最優工藝條件下得到的橄欖果酒，感官評分為（91.83±0.67）分，色澤呈現出金黃色、清亮透明，果香與酒香協調，口感圓潤醇厚、回味綿延，具有橄欖的典型風味。橄欖果酒中總酚含量為（27.76±0.36）g/L、總酸含量為（5.00±0.13）g/L、還原糖含量為（2.53±0.09）g/L、維生素C含量為（30.49±3.10）mg/L，共檢測出38種揮發性風味物質，賦予了橄欖果酒特殊的果酒風味。本研究在橄欖果酒發酵工藝參數方面具有一定的創新性和實用價值，研究結果為橄欖果酒的研發、加工與生產提供了新的指導方向，為橄欖精深加工產品開發提供思路。