不同釀酒酵母對槜李果酒發酵及揮發性香氣成分的影響

郭晨晨，王鑫濤，勞鳳仙，許光治*

（浙江農林大學 食品與健康學院，浙江 杭州 311300）

槜李又名“醉李”，為薔薇科（Rosaceae）李屬（PrunusLinn.）[1-2]，果形扁圓，果大核小，熟后化漿，蜜甜酒香，原產于浙江嘉興，其栽培歷史有2 500余年[3]。研究表明，槜李果實營養豐富，可溶性固形物含量為17.3%，糖酸比為14.52，維生素C含量為0.238 7 mg/g[1]，還含有類黃酮、多酚、類胡蘿卜素等生物活性成分，具有獨特的芳香氣味，被譽為“群李之冠”[3]。

槜李屬于呼吸躍變型水果，果實于6月下旬至7月成熟，采后生理活動旺盛，果實迅速進入呼吸高峰期，易受乙烯作用而快速軟化，不耐貯存和運輸[4]。目前，對槜李的研究主要集中在貯藏保鮮[4-5]等方面，為了提高其商用價值，可將其加工成果酒銷售，營養豐富、口感柔和，能夠促進消化，有助于身體健康[6]。在果酒釀造的過程中，釀酒酵母是果酒發酵的主導微生物，發酵過程中酵母的生長代謝會對果酒中的物質組分產生影響，直接影響到所釀果酒的風味及理化性質，決定了果酒品質的優劣[7]。趙文英等[7]選取5種商業釀酒酵母發酵樹莓果酒，分析比較酵母發酵曲線、有機酸及非花色苷單體酚類物質含量等，篩選出適合樹莓果酒釀造的優良菌株Montrachet。廖麗等[8]以香氣成分作為果酒品質的主要評價指標，采用8種釀酒酵母發酵脆紅李果酒，得到更適合脆紅李發酵的釀酒酵母D254，此酵母發酵的果酒風味較好，具有脆紅李的典型風味。當前，果酒的釀造幾乎都采用商業釀酒酵母發酵制得[9]，而槜李果酒釀造缺少專用發酵酵母。

本研究以槜李果實為原料，分別以酵母LBY、SLB和SY為發酵菌種，制備槜李果酒，對其理化指標進行檢測，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometer，HSSPME-GC-MS）對揮發性香氣成分進行分析，并對其進行主成分分析（principal component analysis，PCA），比較不同酵母對槜李果酒品質的影響，以期篩選出能體現槜李特征的釀酒酵母，為槜李果酒的開發提供理論依據，保證槜李資源的可持續發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

槜李（成熟度80%）：采自浙江省嘉興市桐鄉市桃園村槜李種植基地；安琪葡萄酒果酒專用酵母SY（簡稱SY）：湖北安琪酵母股份有限公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）LEVULINE BRG YSEO（簡稱LBY）和SELECTYS LA BAYANUS（簡稱SLB）：煙臺帝伯仕自釀機有限公司。

蘆丁、沒食子酸（純度均＞98%）、甲醇（色譜純）、1-辛醇（色譜純）：國藥集團化學試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、福林酚（均為分析純）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LDZM-60KCS-Ⅱ立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；GL-3250A磁力攪拌器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DGG-9053AD型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海森信實驗儀器有限公司；TGL-20B-C高溫臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；DNP-9082恒溫培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；WYT-4型手持糖度計：泉州中友光學儀器有限公司；UV-5500紫外可見分光光度計：METASH上海元析儀器有限公司；QP210PLUS氣相色譜-質譜聯用儀：日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 槜李果酒加工工藝流程及操作要點

槜李→挑選、清洗浸泡→打漿、成分調整→接種酵母→恒溫發酵→澄清、過濾→滅菌→灌裝→成品

操作要點：

原料處理：挑選大小成熟度一致、無病蟲害、無機械損傷的槜李，用清水洗刷干凈，撈出瀝干。

打漿：加入槜李2倍質量的水打漿，添加白砂糖調整可溶性固形物含量為35%[10]，獲得槜李果汁。

接種酵母、恒溫發酵：將槜李果汁分裝于發酵罐中（1 L），記錄質量，酵母發酵劑37 ℃溫水活化30 min后，以接種量1（106CFU/mL接種，于25 ℃恒溫箱中發酵，記錄發酵罐的質量，發酵至恒質量即為發酵終點。

澄清、過濾、滅菌：靜置后用紗布過濾得清液，在70 ℃下巴氏滅菌20 min，灌裝后獲得槜李果酒成品。

1.3.2 理化指標的測定

可溶性固形物：采用手持糖度計測定；酒精度：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，采用酒精度計測定；總酸：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，采用酸堿滴定法測定；總酚：參考CHAOVANALIDIT A等[11]的福林酚（Folin-Ciocalteu）試劑比色法測定；總黃酮：參考硝酸-亞硝酸鈉比色法測定[12]；DPPH自由基清除率：參考BARBA F J等[13]的方法測定。

1.3.3 揮發性香氣成分的測定

采用HS-SPME-GC-MS檢測槜李果汁及槜李果酒中的揮發性香氣成分。

HS-SPME條件：取3 mL樣品至10 mL頂空瓶內，加入1.0 g氯化鈉和50 μL 1-辛醇（質量濃度為500 mg/L），密封后將經老化的萃取針插入樣品頂空處，置于50 ℃水浴中，待放穩后推出萃取針頭，頂空萃取30 min，將萃取頭插入氣相色譜-質譜（GC-MS）聯用儀進樣口，解吸3 min。

GC條件：RTX-5MS色譜柱（30 mm×0.25 mm×0.25 mm）；載氣為高純氦氣（He）；流速3 mL/min；不分流進樣；進樣口溫度250 ℃；升溫程序為起始溫度40 ℃，保持5 min，以6 ℃/min升溫至120 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升溫至250 ℃，保持15 min。

MS條件：電子電離（electron ionization，EI）源；離子源溫度230 ℃；接口溫度250 ℃；質量掃描范圍40～550 m/z。

定性、定量分析：由GC-MS分析得到的質譜數據經計算機在美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）標準譜庫的檢索比對進行定性（要求匹配度＞800，最大值為1 000）；采用內標法進行半定量分析。

1.3.4 數據處理

所有實驗均重復3次，結果以“平均值±標準差”表示。采用Microsoft Office Excel 2021軟件進行數據整理，SPSS Statistics 26.0軟件進行統計分析，DataGraph 4.6軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同釀酒酵母的發酵曲線

酵母在發酵過程中分解葡萄糖產生酒精并釋放CO2，因此發酵液質量下降速度可作為發酵過程的監測指標，比較酵母SY、LBY和SLB發酵槜李的效果，不同釀酒酵母的發酵曲線見圖1。由圖1可知，槜李果酒在發酵第8天左右完成主發酵，發酵時間為0～2 d，酵母LBY和SLB的單日質量損失逐漸增加，發酵效力高；第2天，發酵速度達到最大，單日質量損失分別為47.4 g和49.9 g；發酵時間為2～4 d，酵母LBY和SLB的單日質量損失逐漸下降；發酵時間＞4 d，酵母LBY和SLB的單日質量損失趨于平穩。發酵時間為0～4 d，酵母SY的單日質量損失逐漸增加；在發酵第4天，單日質量損失達到最大值，為23.5 g；4～8 d，酵母SY的單日質量損失逐漸下降；發酵時間＞8 d，酵母SY的單日質量損失趨于平穩。總體而言，酵母LBY和SLB的發酵速度快且發酵周期短，適合果酒工業化生產，發酵效果優于酵母SY。

圖1 不同釀酒酵母的發酵曲線Fig.1 Fermentation curves of different Saccharomyces cerevisiae strains

2.2 不同釀酒酵母對槜李果酒可溶性固形物和酒精度的影響

可溶性固形物能反映酵母的生長繁殖情況及耗糖能力[10]。由圖2可知，3種釀酒酵母發酵過程中槜李果酒的可溶性固形物含量均呈逐漸下降趨勢。發酵時間為0～4 d，可溶性固形物含量大幅度下降，發酵時間為4～8 d，可溶性固形物含量趨于穩定。發酵結束時，3種酒樣的可溶性固形物含量基本相等，說明這3種酵母的發酵程度接近，與酵母發酵曲線相吻合。其原因可能是發酵初期酵母利用槜李漿液中可發酵性糖，為其生長繁殖提供能量和營養，導致可溶性糖類大量減少，隨著發酵進程，發酵液中酒精度和酸度增加，酵母開始沉降和衰亡[14]，分解糖的能力降低。

圖2 不同釀酒酵母發酵過程中可溶性固形物含量的變化Fig.2 Changes of soluble solid contents during the fermentation with different Saccharomyces cerevisiae strains

發酵結束時，酵母SY、LBY、SLB發酵酒樣的酒精度分別為9.6%vol、9.4%vol和8.6%vol，均符合國標GB/T 15037—2006《葡萄酒》要求。

2.3 不同釀酒酵母發酵對槜李果酒總酸的影響

不同釀酒酵母發酵過程中總酸含量的變化見圖3。由圖3可知，發酵時間為0～2 d時，除了酵母SY發酵酒樣，槜李果酒樣品總酸含量逐漸下降；當發酵時間2～4 d時，3個酒樣總酸含量逐漸增加；當發酵時間＞4 d時，總酸含量的變化趨于平穩。其原因可能是，發酵初期部分酸類物質被代謝，生成酯類物質，之后隨著發酵進程產生其他揮發酸，總酸又增加至適當水平[15]。發酵結束時，酵母SY、LBY、SLB發酵酒樣的總酸含量分別為9.04 g/L、8.19 g/L和7.52 g/L，可見不同酵母發酵酒樣的總酸含量存在顯著差異（P＜0.05），其中，酵母SLB發酵酒樣的總酸含量較低，說明其在發酵槜李果酒中起到一定降酸效果。據研究報道[1，6]，李子果酒因酸度較高而影響口感，槜李果實中含有蘋果酸、奎尼酸、檸檬酸等有機酸，其中蘋果酸高達12.1 mg/g，因此，酵母在果酒發酵過程中的降酸能力也值得關注。總體而言，酵母SY、LBY發酵酒樣的總酸較發酵前有所上升，而酵母SLB發酵酒樣的總酸含量較初始值降低7.4%，表現出良好的降酸能力，在保持酒體口感平衡方面具有優勢。

圖3 不同釀酒酵母發酵過程中總酸含量的變化Fig.3 Changes of total acid contents during the fermentation with different Saccharomyces cerevisiae strains

2.4 發酵過程中總酚和總黃酮含量變化及抗氧化性分析

2.4.1 不同釀酒酵母發酵對槜李果酒總酚和總黃酮的影響酚類、黃酮類物質對果酒的感官特性和營養性質等有重要影響，是果酒中起抗氧化作用的主要功能性成分[16]。不同釀酒酵母發酵過程中總酚和總黃酮含量的變化見圖4。由圖4可知，發酵時間為0～4 d時，3種酵母發酵酒樣的總酚含量均呈逐漸下降趨勢；發酵時間＞4 d時，總酚含量變化趨于平穩。發酵結束時，酵母SY、LBY、SLB發酵酒樣的總酚含量分別為0.59 g/L、0.55 g/L和0.53 g/L，無顯著差異（P＞0.05），槜李果酒的總酚保留率約25%。主要原因是酚類物質為熱敏性物質，一方面，多酚等大分子物質在酶的作用下分解；另一方面，酚類物質與發酵過程中的次級代謝產物發生氧化、聚合等化學反應，隨著發酵進程，損失越嚴重[17]。哈之才等[18]研究發現，寒富蘋果酒發酵過程中的總酚含量呈波動減少趨勢，保留率約40%；胡冀太等[19]研究發現，山楂酒發酵過程中總酚含量呈上升趨勢，而李楠等[20]研究發現，山楂酒發酵過程中總酚含量幾乎保持平穩。由此可知，果酒發酵過程中對總酚含量變化的研究結果并不一致，這可能與水果自身特性、發酵工藝條件（如預處理方式、發酵溫度）等有關[21]。

圖4 不同釀酒酵母發酵過程中總酚（A）和總黃酮（B）含量的變化Fig.4 Changes of total phenols (A) and total flavonoids (B)contents during the fermentation with different Saccharomyces cerevisiae strains

發酵0～4 d時，酵母SY、LBY、SLB發酵酒樣的總黃酮含量呈下降趨勢；發酵時間為4 d時，總黃酮含量均下降到最低值，可能是黃酮類物質發生氧化反應導致含量減少；當發酵時間為4～6 d時，總黃酮含量逐漸增加，可能原因是黃酮類物質隨著酒精度的增加被浸提出來；當發酵時間＞6 d時，總黃酮含量有所下降，這是由于酒樣與空氣接觸發生氧化反應。發酵結束時，酵母SY、LBY、SLB發酵酒樣的總黃酮含量分別為1.16g/L、1.31g/L和0.93g/L，相較于初始值仍有一定程度降低，且下降幅度存在顯著差異（P＜0.05），其中，酵母LBY發酵酒樣的總黃酮含量相對較高。

2.4.2 不同釀酒酵母發酵對槜李果酒抗氧化活性的影響

由圖5可知，在發酵過程中，酵母SY、LBY發酵酒樣的DPPH自由基清除率呈先下降后上升再下降的趨勢；酵母SLB發酵酒樣的DPPH自由基清除率呈先下降后趨于平穩的趨勢，發酵結束時，酵母SY、LBY、SLB發酵酒樣的DPPH自由基清除率分別為76.16%、73.65%和70.56%，無顯著差異（P＞0.05）。

圖5 不同釀酒酵母發酵過程中抗氧化活性的變化Fig.5 Changes of antioxidant activities during the fermentation with different Saccharomyces cerevisiae strains

2.5 不同釀酒酵母發酵槜李果酒的揮發性香氣成分分析

2.5.1 揮發性香氣成分的氣相色譜-質譜分析

槜李果汁及不同釀酒酵母發酵槜李果酒的揮發性香氣成分檢測結果見表1。由表1可知，槜李果汁共檢測出31種揮發性香氣成分，相對含量為89.96%。3種槜李果酒中共檢測出59種揮發性香氣成分，包括酯類34種，醇類10種，酸類5種，醛酮類5種，酚類2種和其他類3種，相對含量分別為81.45%、13.58%、2.84%、0.86%、0.65%、0.63%；酵母SY、LBY、SLB發酵酒樣的揮發性香氣成分分別檢測出47種、37種、41種，揮發性香氣成分相對含量分別為86.45%、92.48%、92.19%，其中酯類物質種類最多，含量最高。檢出共有揮發性香氣成分29種，占比49%，說明3種酵母間有一定發酵共性。經過發酵，槜李果酒揮發性香氣成分中酯類物質的種類和相對含量增加，酵母SY、LBY、SLB發酵酒樣的酯類物質種類分別增加14種、5種、9種，相對含量分別增加59.05%、65.51%、48.44%；醇類物質的種類數量基本不變，相對含量明顯減少，酵母SY、LBY、SLB發酵酒樣的醇類物質相對含量分別減少45.39%、46.01%、29.75%；醛酮類物質的種類和相對含量明顯減少，酵母SY、LBY、SLB發酵酒樣的醛酮類物質種類分別減少5種、4種、3種，相對含量分別減少21.42%、20.29%、20.68%。相較于發酵前，揮發性香氣成分種類和相對含量增加，說明酵母發酵起到改善果酒風味的效果。

表1 槜李果汁及不同釀酒酵母發酵槜李果酒的揮發性香氣成分檢測結果Table 1 Determination results of volatile aroma components in plum juice and plum wines fermented by different Saccharomyces cerevisiae strains

酯類物質是果酒中主要呈香和呈味化合物，主要產生于酵母發酵過程，有助于酒體形成濃郁厚重的風味[22]。酯類物質是3種酵母所發酵槜李果酒香氣的主體成分，其中酵母LBY發酵酒樣的酯類物質相對含量最高，達到81.45%。酵母SY、LBY、SLB發酵酒樣中分別檢測出酯類物質28種、19種和23種，其中共有成分16種。辛酸乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯在3種酒樣中均檢出，且相對含量較高，賦予槜李果酒白蘭地酒香、脂肪香、菠蘿、香蕉和梨香[23]，辛酸乙酯和癸酸乙酯是相對含量最高的2種酯類物質，這與劉曉柱等[24]制備的空心李果酒的研究結果一致。此外，酵母SY發酵酒樣中檢出順式-4-辛烯酸乙酯和乙酸苯乙酯，賦予酒體蘋果香、玫瑰花香和蜂蜜味；酵母SLB發酵酒樣中檢出乙酸丁酯、異丁酸異戊酯、丁酸戊酯、順式-3-己烯酸乙酯和月桂酸乙酯，賦予酒體蘋果、杏子、桃等水果香[23]、青草香和奶香。

醇類物質是構成果酒風味特征的重要香氣成分，主要來源于酵母發酵過程中氨基酸代謝或糖代謝[25]，其種類和含量受菌種、發酵過程等多種因素影響[26]。3種酒樣中共檢測出醇類物質10種，其中共有成分7種，分別為異戊醇、異丁醇、正己醇、葉醇、（S）-2-辛醇、正辛醇、苯乙醇，賦予槜李果酒白蘭地香氣、青草香、茉莉、檸檬和玫瑰花香[27]。在3種酒樣中，酵母SLB發酵酒樣的醇類物質相對含量最高，為22.90%，其檢出的7種共有醇類物質相對含量也最高，這些高級醇對果酒香氣形成有積極作用，能增加酒體復雜感，并有襯托酯香的作用[29]。芳樟醇僅在酵母SY發酵酒樣中檢出，是該種酒樣的特有香氣成分，可賦予酒體玫瑰花香、柑橘香[30]。除辛醇外，其他5種醇類物質也在趙馳等[28]制備的李子果酒中檢出，為發酵過程中主要變化的醇類物質。

酸類物質是果酒香氣的重要協調成分，適量的酸能改善果酒的口感和色澤[29]，含量過多會產生酸敗和刺激性異味。酵母SY、LBY、SLB發酵酒樣中酸類物質相對含量分別為2.93%、2.55%和2.22%，3種酒樣中共檢測出酸類物質6種，其中共有成分3種，分別為辛酸、癸酸和己酸。辛酸是槜李果酒中檢出相對含量最高的揮發酸，這與高紅芳等[26]制備的黑布林果酒的研究結果一致，稀釋后呈水果香氣，能賦予酒體草莓、菠蘿、桃等水果風味[26-27]；癸酸和己酸可賦予酒體脂肪味、奶酪味。異丁酸僅在酵母SLB發酵酒樣中檢出，也能賦予酒體奶酪味。

由表1可知，槜李果酒中還檢測到醛酮類、酚類和其他類香氣成分。醛酮類、酚類物質雖然相對含量低，但對酒體特征風味的形成仍有一定貢獻。3種酒樣中均檢出的仲辛酮帶有花草香，酵母SY、SLB發酵酒樣中檢出的癸醛帶有柑橘香、蠟香[23]，酵母LBY、SLB發酵酒樣中檢出的苯甲醛帶有杏仁味、風信子香[23]，酵母SY發酵酒樣中檢出的異丁香酚帶有丁香味[30]，它們能對槜李果酒的香氣起補充和修飾作用。

2.5.2 主成分分析

由于發酵香氣成分復雜，為直觀體現3種釀酒酵母發酵槜李果酒的香氣成分差異，對槜李果汁及發酵酒樣的揮發性香氣成分進行主成分分析，結果見表2。由表2可知，以特征值>1.0的原則提取出2個主成分，PC1和PC2方差貢獻率分別為52.627%和33.115%，前2個主成分累計方差貢獻率為85.742%，基本能反映香氣成分的大部分信息，可作為數據分析的有效成分。揮發性香氣成分主成分分析得分圖和因子載荷圖見圖6。

表2 主成分的特征值及方差貢獻率Table 2 Eigenvalues and variance contribution rates of principle components

圖6 槜李果酒樣品揮發性香氣成分主成分分析得分圖（A）和載荷圖（B）Fig.6 Score plot (A) and load plot (B) of principal component analysis of volatile aroma compounds in plum wines samples

由圖6可知，4種樣品具有明顯的區域分布特征，酵母SLB發酵酒樣位于PC1和PC2正半軸，酵母LBY和SY發酵酒樣均位于PC1正半軸和PC2負半軸，槜李果汁位于PC1和PC2負半軸，3種槜李果酒與槜李果汁相距較遠，且PC1正半軸香氣物質和呈香類型較多，說明3種釀酒酵母均有較好的產香性能。具體來說，酵母SLB發酵酒樣位于第一象限，己酸乙酯、乙酸異戊酯、壬酸乙酯、己酸、異丁醇等為其特征香氣成分，呈菠蘿、香蕉等水果味、玫瑰花香、奶酪味和生青味。酵母SY和LBY發酵酒樣同時位于第四象限且距離較近，癸酸乙酯、辛酸、癸酸為2種酒樣的主要香氣成分，呈花果香、水果味和奶酪味；辛酸甲酯、己酸異戊酯、9-癸烯酸乙酯等為酵母SY發酵酒樣的特征香氣成分，呈甜橙香、蘋果和菠蘿等水果味、生青味；辛酸異戊酯、癸酸異戊酯等為酵母LBY發酵酒樣的特征香氣成分，呈白蘭地酒香、玫瑰花香。槜李果汁位于第三象限，乙酸丁酯、乙酸葉醇酯、己醛等為其特征香氣成分，呈菠蘿味、水果香和青草香。

3 結論

該研究以槜李果實為原料，選用3種釀酒酵母發酵菌種制備槜李果酒。結果表明，3種酵母的發酵程度基本相同，酵母LBY和SLB發酵速度快且發酵周期短，發酵效果優于酵母SY。從理化指標來看，不同酵母發酵酒樣的酒精度均符合國標要求，酵母SLB具有降酸作用，其發酵槜李果酒的酒精度為8.6%vol，總酸含量為7.52 g/L。不同酒樣均具有一定的抗氧化活性；不同果酒樣品的總酚含量、DPPH自由基清除率無顯著差異（P＞0.05），酵母LBY發酵酒樣的總黃酮含量較高。從揮發性香氣成分來看，槜李果酒共檢出揮發性香氣成分59種，其中，酯類34種、醇類10種、酸類5種、醛酮類5種、酚類2種和其他類3種，共有成分29種，3種酒樣的特征香氣成分呈香效果相似，以花果香和奶香為主，其中酵母SLB發酵酒樣的揮發性香氣成分種類較多、相對含量較高，檢出乙酸丁酯、月桂酸乙酯等多種特有香氣成分，酒體香氣更復雜。綜合比較，酵母SLB更適合于槜李果酒的發酵。