離子色譜法測(cè)定白酒中10種陰離子

王 鑫，王小平*，劉忠瑩，張定秋，朱敏敏，何葉馨，劉云龍，鄭紅毅

（1.四川省食品檢驗(yàn)研究院，四川 成都 610097；2.國家市場監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（白酒監(jiān)管技術(shù)），四川 成都 610097）

白酒是我國獨(dú)具特色的酒，承載著我國的悠久歷史和文化[1-3]。近幾年，白酒行業(yè)負(fù)面新聞不斷，從“勾兌”、“塑化劑”、“年份酒”、“敵敵畏”等事件[4-8]，讓白酒蒙上了陰影，為讓消費(fèi)者對(duì)中國白酒重樹信心，監(jiān)管部門加大了對(duì)白酒的監(jiān)管，特別是白酒的風(fēng)險(xiǎn)管控[9-10]。陰離子廣泛存在于自然界中，其關(guān)乎白酒的品質(zhì)和安全，主要通過原料選取、加工助劑以及人為添加等步驟引入。一些陰離子會(huì)直接影響白酒口感，如氯離子（Cl-）、硝酸根離子（NO3-）、硫酸根離子（SO42-）使酒變得醇和，刺激感減弱，磷酸根離子（PO43-）使酒有苦澀感[11]。另一些陰離子會(huì)直接影響白酒的食用安全，如溴酸根離子（BrO3-）為2B類致癌物，會(huì)增加人類患癌癥的幾率[12-13]；氯酸根離子（ClO4-）會(huì)導(dǎo)致甲狀腺功能退化，影響人體發(fā)育，尤其對(duì)胚胎、孕婦、哺乳期婦女和少年兒童影響更為顯著，成年人持續(xù)攝入高氯酸鹽，機(jī)體會(huì)發(fā)生骨髓造血細(xì)胞再生障礙[14-16]；硫氰根離子（SCN-）在體內(nèi)被轉(zhuǎn)化為氰根離子，其在體內(nèi)很快與細(xì)胞色素氧化酶中的三價(jià)鐵離子結(jié)合，抑制酶的活性，使組織不能利用氧，引起惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等腸道功能紊亂，血壓波動(dòng)，心率減慢等癥狀[17-19]。這些有毒有害的陰離子會(huì)在工業(yè)中應(yīng)用或產(chǎn)生，如果一旦進(jìn)入環(huán)境，會(huì)隨地下水和地表水快速擴(kuò)散，造成污染的擴(kuò)大化，即有可能造成白酒被污染[20-21]，因此有必要對(duì)白酒中的危害陰離子建立一個(gè)可行檢測(cè)方法，對(duì)其進(jìn)行監(jiān)控。

離子色譜（ion chromatography，IC）法是檢測(cè)陰離子最常用的方法，其具有快速、靈敏、重復(fù)性好、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，在環(huán)境分析、食品分析及藥物分析中廣泛應(yīng)用。目前出現(xiàn)了很多關(guān)于離子色譜在酒類中應(yīng)用報(bào)道，鄒沫君等[22]建立了用離子色譜-電導(dǎo)檢測(cè)法測(cè)定白酒中氟離子的方法，其線性范圍廣，準(zhǔn)確性和精密度良好，操作較簡便；魯廣秋等[23]應(yīng)用離子色譜法測(cè)定出胡蜂酒中5種陰離子（氟（F-）、Cl-、溴（Br-）、NO3-、PO43-）含量，為評(píng)價(jià)胡蜂酒提供新思路；ZHONG F J 等[24]應(yīng)用離子色譜法實(shí)現(xiàn)了在33 min內(nèi)分離測(cè)定出白酒中甲酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、草酸鹽、琥珀酸鹽、谷氨酸鹽、氟化物、氯化物和硫酸鹽等化合物；BILGˇI ALKAYA D等[25]建立了一種應(yīng)用離子色譜法在22 min內(nèi)分離測(cè)定出葡萄酒中七種無機(jī)陰離子（氟化物、氯化物、亞硝酸鹽、硝酸鹽、亞硫酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽）的方法，該方法定量限為0.5 mg/L；LI F等[26]建立了一種電導(dǎo)結(jié)合脈沖安培檢測(cè)的閥切換離子色譜法，能夠同時(shí)測(cè)定葡萄酒中的有機(jī)酸、無機(jī)陰離子和醛酚；WU J等[27]應(yīng)用固相微萃取法結(jié)合離子色譜法測(cè)定出葡萄酒中的痕量陰離子。離子色譜法測(cè)定酒中糖醇、醛酸和離子等化合物是較為成熟的，但針對(duì)白酒中多種陰離子檢測(cè)相對(duì)較少，特別是污染物（BrO3-、次氯酸根（ClO3-）、SCN-、ClO4-）。為了更好地監(jiān)控白酒安全風(fēng)險(xiǎn)，本研究建立一種離子色譜法測(cè)定白酒中10種陰離子（BrO3-、Cl-、ClO3-、Br-、NO3-、SO42-、碘（I-）、PO43-、SCN-、ClO4-）的方法，并進(jìn)行方法學(xué)考察，旨在為白酒中多種陰離子測(cè)定提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同廠家白酒（酒精度為36%vol、38%vol、40%vol、42%vol、45%vol、52%vol、60%vol）：市售；BrO3-、Cl-、ClO3-、Br-、NO3-、SO42-、I-、PO43-、SCN-、ClO4-標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL）：國家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；C18小柱（60 mg/3 mL）：美國菲羅門公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ICS-5000離子色譜儀（帶電導(dǎo)檢測(cè)器、氫氧化鉀自動(dòng)淋洗液發(fā)生器）：美國Thermo Fisher公司；EG37C加熱板：北京萊博艾德科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 離子色譜條件

分析柱：IonPac AS19色譜柱（250 mm×4 mm）、IonPac AG19保護(hù)柱（50 mm×4 mm）：流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：25 μL；抑制電流：174 mA；梯度淋洗條件：0～15.0 min，3 mmol/L～20 mmol/L KOH；15.0～15.1 min，20 mmol/L～10 mmol/L KOH；15.1～30.1 min，10 mmol/L～70 mmol/L KOH，30.1 ～35 min，70 mmol/L ～3 mmol/L KOH[22]。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別移取適量標(biāo)準(zhǔn)溶液至100 mL的容量瓶中，用去離子水定容，配制成BrO3-、Cl-、ClO3-、Br-、NO3-、SO42-、PO43-、SCN-、ClO4-質(zhì)量濃度分別為0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10 mg/L和I-質(zhì)量濃度分別為0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.3.3 樣品前處理

移取10 mL白酒于50 mL燒杯中，置于180 ℃電熱板上，加熱濃縮至溶液至5 mL，取出樣品，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，用去離子水定容至刻度，過0.45 μm有機(jī)濾膜和C18小柱（預(yù)先用甲醇和水活化），收集溶液至1.5 mL進(jìn)樣小瓶[23，28]。

1.3.4 方法學(xué)考察

（1）重復(fù)性試驗(yàn)

取1.3.2 中1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)測(cè)量6 次，以出峰時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差說明方法的定性重復(fù)性和以峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差說明方法的定量重復(fù)性。

（2）加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)

取52%vol 白酒10 mL分別加入10種陰離子（BrO3-、Cl-、ClO3-、Br-、NO3-、SO42-、I-、PO43-、SCN-、ClO4-），均為2.5 μg（低）、10 μg（中）、25 μg（高），白酒樣品加標(biāo)后的操作跟1.3.3一致，重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算精密度試驗(yàn)及加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010軟件對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪制表格，采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白酒樣品經(jīng)C18小柱預(yù)處理的結(jié)果

白酒中乙醇占比很高，如果不經(jīng)過任何處理直接進(jìn)樣，乙醇會(huì)影響目標(biāo)物質(zhì)的測(cè)定，且會(huì)損害儀器和色譜柱，為避免還原性離子（如I-）被氧化，本試驗(yàn)采用高溫短時(shí)處理（180 ℃加熱約20 min）能夠解決以上問題[23，29]，去除白酒中乙醇，同時(shí)達(dá)到濃縮樣品、降低方法檢出限的目的。有文獻(xiàn)報(bào)道C18小柱應(yīng)用于白酒的前處理，可以去除樣品中部分有機(jī)物[28]，有利于目標(biāo)物的測(cè)定。白酒樣品經(jīng)C18小柱預(yù)處理前后的離子色譜分析結(jié)果見圖1。由圖1可知，白酒樣品沒有經(jīng)過C18小柱預(yù)處理時(shí)，在5～10 min之間出現(xiàn)很大的干擾峰，這可能是樣品中不易揮發(fā)的醛類和酸類；在BrO3-和Cl-出峰位置有一個(gè)很大的干擾峰，嚴(yán)重影響B(tài)rO3-和Cl-的測(cè)定。經(jīng)C18小柱的處理后，5～10 min的干擾峰明顯減小，特別是BrO3-和Cl-出峰位置的干擾峰得到去除，BrO3-和Cl-出峰清晰，基線更加平穩(wěn)，有利于樣品的測(cè)定。

圖1 白酒樣品經(jīng)C18小柱預(yù)處理前后的離子色譜圖對(duì)比Fig.1 Comparison of ion chromatograms of Baijiu sample before and after C18 column pretreatment

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

分別將本研究中涉及的10種陰離子配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照所建立的分析方法進(jìn)行測(cè)定，離子色譜圖見圖2。由圖2可知，在本試驗(yàn)條件下，測(cè)定的10種陰離子（BrO3-、Cl-、ClO3-、Br-、NO3-、SO42-、I-、PO43-、SCN-、ClO4-）在35 min內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn)良好分離。

圖2 10種陰離子標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子色譜圖Fig.2 Ion chromatogram of 10 anionic standard solutions

以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表1。

表1 白酒中10種陰離子的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 1 Regression equation of standard curve, linear range, correlation coefficient, detection limit and quantitation limit of 10 anions in Baijiu

由表1可知，分離度為2.17～10.51，能達(dá)到測(cè)定要求。I-在0.5～10.0 mg/L范圍內(nèi)、其他9種陰離子的線性范圍為0.1～10.0 mg/L，相關(guān)系數(shù)R均＞0.997。以3倍信噪比計(jì)算10種陰離子的檢出限，除I-檢出限較大外，其他陰離子檢出限均低于0.05 mg/L，以10倍信噪比計(jì)算10種陰離子的定量限，除I-外，其他陰離子定量限不超過0.1 mg/L，表明能滿足10種陰離子的檢測(cè)分析要求。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取10種陰離子濃度為1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)測(cè)量6次，以出峰時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差說明方法的定性重復(fù)性，以峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差說明方法的定量重復(fù)性，結(jié)果見表2。由表2可知，定性和定量的重復(fù)性很好，其定性重復(fù)性試驗(yàn)的RSD為0.11%～0.38%，其定量重復(fù)性試驗(yàn)的RSD為0.5%～3.9%。結(jié)果表明該檢測(cè)方法重復(fù)性良好。

表2 定性和定量重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of qualitative and quantitative repeatability tests

2.4 精密度和加標(biāo)回收率試驗(yàn)

采用52%vol白酒樣品進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，移取10 mL白酒樣品加標(biāo)后按照1.3.3處理后上機(jī)測(cè)定。本試驗(yàn)分別考察2.5 μg、1.0 μg、2.5 mg/L低、中、高加標(biāo)水平條件下回收率，精密度及加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3可知，除樣品中BrO3-、ClO3-和I-未檢出，其他7種陰離子均有檢出；10種陰離子精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD均＜10%，說明方法的精密度好；除低加標(biāo)量（2.5 μg）條件下BrO3-和I-加標(biāo)回收率較差（分別36%和30%），其他8種陰離子（Cl-、ClO3-、Br-、NO3-、SO42-、PO43-、SCN-、ClO4-）的加標(biāo)回收率為73%～128%；I-加標(biāo)回收率較低，可能是因?yàn)镮-比較活潑、易與氧氣反應(yīng)，造成了部分I-損失；BrO3-隨著加標(biāo)水平提高，其加標(biāo)回收率明顯升高，高水平加標(biāo)量可達(dá)到77%。由于BrO3-出峰處有干擾峰的影響，因此低含量BrO3-的準(zhǔn)確定量，有待進(jìn)一步研究，因此方法除低含量的BrO3-和I-準(zhǔn)確性較差外，其他離子的低中高含量準(zhǔn)確度都較好。結(jié)果表明，該方法精密度及準(zhǔn)確度較好。

2.5 白酒樣品中10種陰離子分析結(jié)果

隨機(jī)選購不同酒廠的同一批次酒，酒精度分別為36%vol、38%vol、40%vol、45%vol、52%vol、60%vol的白酒樣品共23個(gè)，采用本試驗(yàn)方法測(cè)定白酒樣品中上述10種陰離子，結(jié)果見表4。由表4可知，Cl-、NO3-、SO42-和PO43-對(duì)白酒口感和感官有直接影響，隨著這4種離子含量的增高，會(huì)抑制白酒呈香，會(huì)使酒更醇和，除磷酸根離子外，其他3種離子能增加白酒的醇甜感[11]。結(jié)果表明，Cl-、NO3-、SO42-和PO43-含量差異很大，如：Cl-含量最高來自兩批酒精度為45%vol的酒樣，為15 mg/L，而最低來自酒精度為52%vol的酒樣，為0.5 mg/L；NO3-最高值和最低值均來自酒精度為60%vol的酒樣，分別為7.7 mg/L和0.43 mg/L；SO42-和PO43-最高值可達(dá)33 mg/L和86 mg/L，而最低分別僅為0.3 mg/L和0.19 mg/L，這可能造成市售白酒口感差異很大的原因。BrO3-是一種致癌物質(zhì)，是禁用物質(zhì)，由于飲用水在使用臭氧消毒的過程中會(huì)產(chǎn)生BrO3-，因此我國的飲用水標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)BrO3-也規(guī)定了限量值。本次檢測(cè)的23個(gè)白酒樣品中有10個(gè)檢出BrO3-，檢出率為43%，最高值為0.45 mg/L，遠(yuǎn)超過了飲用水中BrO3-限量值0.01 mg/L，因此白酒中BrO3-的含量應(yīng)引起重視。由于含氯消毒劑和含氯鹽的使用，造成ClO3-和ClO4-在水中或其他食品中被檢出，ClO3-和ClO4-危害很大，特別是ClO4-，會(huì)影響人體發(fā)育，造成機(jī)體會(huì)發(fā)生骨髓造血細(xì)胞再生障礙。ClO3-和ClO4-對(duì)白酒還未造成較嚴(yán)重的污染，雖然ClO3-檢出13批，占57%，但測(cè)定值為0.04～0.08 mg/L，而檢出ClO4-僅有2批，且測(cè)定值僅為0.08～0.09 mg/L。SCN-會(huì)造成神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和皮膚受到損害，從2005年起，我國不允許SCN-作為保鮮劑應(yīng)用于乳制品中。SCN-在乳制品中應(yīng)用的研究報(bào)道較多，鮮見其在白酒中應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)檢出11批SCN-，占比48%，最高值可達(dá)1.2 mg/L，由此白酒中SCN-亦應(yīng)引起重視。

表4 白酒樣品中10種陰離子含量的檢測(cè)結(jié)果Table 4 Determination results of 10 anions contents in Baijiu samples

3 結(jié)論

采用離子色譜法測(cè)定10種陰離子（BrO3-、Cl-、ClO3-、Br-、NO3-、SO42-、I-、PO43-、SCN-、ClO4-），該檢測(cè)方法分離度好（2.17～10.51），色譜峰型好，線性范圍寬（I-為0.5～10.0 mg/L、其他均為0.1～10.0mg/L），線性相關(guān)性好（相關(guān)系數(shù)R＞0.997）。重復(fù)性、精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別均＜5%、＜10%，除BrO3-和I-在低加標(biāo)量（2.5 μg）條件下加標(biāo)回收率較差（分別36%和30%），其他8種陰離子（Cl-、ClO3-、Br-、NO3-、SO42-、PO43-、SCN-、ClO4-）的加標(biāo)回收率為73%～128%，說明該方法的重復(fù)性、精密度、準(zhǔn)確度較好。采用本方法對(duì)市售23批白酒中樣品進(jìn)行了測(cè)定，Cl-、NO3-、SO42-和PO43-各個(gè)離子之間的含量差異很大，如SO42-和PO43-最高值可達(dá)33.0 mg/L和86.0 mg/L，而最低分別僅為0.3 mg/L和0.19 mg/L；BrO3-、ClO3-、SCN-和ClO4-分別檢出10、13、11、2批，占比為43%、56%、48%、9%，其中ClO3-和ClO4-檢出值較低，分別為0.04～0.08 mg/L、0.08～0.09 mg/L，而BrO3-和SCN-檢出的最高值分別為0.49 mg/L、1.2 mg/L，這兩種離子-對(duì)白酒有一定的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)該引起注意。