UV-ARTP復合誘變選育高產纖維素酶菌株

耿海波

（1.石家莊職業技術學院 食品與藥品工程系，河北 石家莊 050081；2.石家莊市建材領域高性能纖維素技術創新中心，河北 石家莊 050081）

纖維素作為世界上產量最高的可再生有機質資源，在植物、海藻、微生物等生物體內廣泛存在，纖維素的有效開發和資源化利用對于整個社會的可持續發展具有重要意義[1]。現如今，纖維素世界年產量已達1 500億t，其中僅秸稈產量就超過60億t，中國秸稈年產量約占世界總量的20%～30%[2-3]。2017年，我國國家發展和改革委員會、國家能源局等十五部門聯合印發的《關于擴大生物燃料乙醇生產和推廣使用車用乙醇汽油的實施方案》中指出：到2025年，力爭纖維素乙醇實現規模化生產，形成更加完善的市場化運行機制[4]，為我國未來纖維素的開發利用指明了方向。纖維素因結構穩定，難以被有效利用，造成了極大的浪費，因此，如何對纖維素類進行降解處理成為國內外研究熱點[5]。

現有纖維素降解的主要方法包括物理法、化學法、物理化學法、生物法和聯合處理法[6]，其中生物法主要為從自然界篩選可分解纖維素的真菌和細菌，它們可產生種類多、數量大的纖維素降解酶，這些纖維素酶雖結構各異，降解作用不同，但是都可以破壞纖維素的化學鍵使其結構裂解[7-8]。生物法反應條件溫和、無污染、成本低、生物轉化率高，在生物質資源轉化方面具有廣闊的應用前景[9]，但是現有微生物所產生的纖維素酶大部分都不同程度地存在酶系不完全、活性不高、酶作用條件苛刻等問題，因此，選育優良的高產纖維素酶的菌株，提高降解纖維素的效率仍然是當前和今后纖維素酶研究的主要任務[10-11]。現已發現的能夠產生纖維素酶的微生物主要集中在真菌中的木霉屬（Trichoderma）、青霉屬（Penicillium）和曲霉屬（Aspergillus）[12-13]，細菌中的芽孢桿菌屬（Bacillus）和節桿菌屬（Arthrobacter）以及放線菌中的鏈霉菌屬（Streptomyces）等[14-15]。其中，木霉是目前工業級水解酶活性較高的菌種之一[6，16]。在此背景下，不斷選育優良的纖維素酶高產木霉菌株，提高菌株的生產穩定性，使其得到生產應用，是纖維素產業發展的重要研究方向[17]。

本研究以前期從河北某生物企業秸稈收儲池篩選的具備一定開發潛力的擬康氏木霉（Trichodermapseudokoningii）TP-89作為出發菌株，利用紫外（ultraviolet，UV）誘變結合常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變技術[18]對其進行誘變處理，篩選纖維素酶高產正突變株，并對其遺傳穩定性進行研究，以期為纖維素酶生產研究乃至工業化生產提供有價值的菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

擬康氏木霉（Trichoderma pseudokoningii）TP-89：本實驗室保藏。

1.1.2 試劑

葡萄糖、乳酸、KH2PO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、（NH4）2SO4、CaCl2·2H2O、FeSO4、CoCl2、MnSO4、ZnSO4、吐溫80：國藥集團化學試劑有限公司；CMC-Na、微晶纖維素：上海沃凱化學試劑有限公司；酵母粉、玉米漿粉、瓊脂粉：北京索萊寶生物科技有限公司；剛果紅染色液、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）試劑：北京雷根生物技術有限公司。以上所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基[19]：去皮馬鈴薯200 g（切塊后100 ℃加熱30 min，過濾后棄掉濾渣），葡萄糖20 g，瓊脂20 g，用蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min，pH自然。

菌絲生長培養基[20]：去皮馬鈴薯200 g（切塊后100 ℃加熱30 min，過濾后棄掉濾渣），葡萄糖20 g，K2HPO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，瓊脂20 g，用蒸餾水定容至1 000 mL，pH 6.0，121 ℃滅菌20 min。

羧甲基纖維素鈉（sodiumcarboxymethyl cellulose，CMCNa）培養基[21]：CMC-Na 15 g，乳糖3 g，KH2PO41 g，（NH4）2SO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，酵母粉1 g，瓊脂20 g，用蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。

產酶培養基[22]：微晶纖維素10 g，玉米漿粉12 g，乳糖5 g，（NH2）2SO22 g，MgSO2·7H2O 1.2 g，CaCl2·2H2O 1.4 g，吐溫80 2 mL，Mandels微量元素營養鹽（配方：FeSO45 g/L、CoCl23.7 g/L、MnSO41.6 g/L、ZnSO41.4 g/L）1 mL，用蒸餾水定容至1 000 mL，pH 4.8，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

ARTP-II型常壓室溫等離子體（ARTP）誘變儀：北京思清源生物科技有限公司；LDZX-50L型高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；ME204型電子分析天平、FE22型pH計：梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；YJ-VS-1型垂直超凈工作臺：無錫一凈凈化設備有限公司；TG16.5型臺式高速離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；BS-2E型恒溫振蕩培養箱：常州恒隆儀器有限公司；DHP-9602型恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；LD-96A型全波長多功能酶標儀：山東萊恩德科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化和孢子懸液的制備

取適量實驗室保藏的擬康氏木霉TP-89，于1 mL無菌水中振蕩搖勻，通過涂布平板法接種到PDA培養基上，于30 ℃恒溫培養7 d后，用接種鏟取0.5 cm×0.5 cm的正方形菌塊，平放到菌絲生長培養基平板上進一步活化，于30 ℃恒溫培養15 d后，收集孢子并用生理鹽水調節孢子濃度為1×106個/mL備用。1.3.2 UV誘變[23]

移取15 mL孢子懸液于無菌培養皿中，在攪拌子作用下將培養皿置于距離紫外燈20 cm處分別照射0 s、20 s、40 s、60 s、80 s、100 s、120 s、140 s、160 s，移取誘變后的孢子懸液用生理鹽水稀釋至104個/mL后，吸取0.1 mL均勻涂布于菌絲生長培養基，避光條件下30 ℃恒溫培養2～3 d，觀察并記錄各平板形成的菌落數，以照射時長為0 s的培養皿為對照組，計算出發菌株在不同誘變時間的致死率，并繪制致死曲線進而確定最佳誘變時長，致死率計算公式如下：

式中：Z表示誘變致死率，%；X1為誘變組平板的菌落數，個；X為對照組平板的菌落數，個。

1.3.3 ARTP誘變[24-25]

保持ARTP誘變儀的工作條件不變，以誘變時間作為變量對孢子懸液進行誘變處理。具體處理流程為：在超凈工作臺中，移取10 μL孢子懸液于直徑5 mm的無菌不銹鋼載片上，注入純度為99.999%的氦氣（He），氣體流速選擇10.0 L/min，設置功率120 W，處理距離2 mm，處理溫度低于40 ℃。出發菌株孢子懸液分別在ARTP誘變儀下照射處理0 s、20 s、40 s、60 s、80 s、100 s、120 s、140 s、160 s，每次誘變后分別將不銹鋼載片置于含990 μL無菌生理鹽水的EP管中，在漩渦器上振蕩5 min。分別對上述孢子懸液進行梯度稀釋至孢子濃度為104個/mL，吸取0.1 mL稀釋液涂布接種到菌絲生長培養基，30 ℃倒置培養48 h后，觀察并記錄菌落數量，計算致死率，并繪制致死曲線，確定最佳誘變處理時間。

1.3.4 UV-ARTP復合誘變

按照1.3.2獲得的最佳誘變條件對出發菌株孢子懸液進行紫外誘變后，初篩出發生正突變的菌株培養并制成孢子懸液，再按照方法1.3.3獲得的最佳誘變條件進行ARTP誘變。

1.3.5 突變菌株的初篩

將誘變后的菌株孢子懸液適當稀釋后涂布于CMC-Na培養基上，30 ℃恒溫培養3 d后，加入5 mL剛果紅染色液到平板表面染色60 min，采用1 mol/L的NaCl溶液洗脫30 min，記錄水解圈直徑與菌落直徑的比值（H/C），H/C大于對照組（未經誘變菌株）的則視為正突變[22]，選取正突變株進行復篩。

1.3.6 突變菌株的復篩

將初篩獲得的菌株接種到200 mL菌絲生長培養基中，30 ℃、180 r/min條件下培養18 h后，制備濃度為1×108個/mL的孢子懸液，然后以1%（V/V）接種量接種到200 mL產酶培養基中，30 ℃、180 r/min條件下培養7 d，每12 h取樣，在離心機中以6000r/min離心10min，取上清液即為粗酶液，測定酶活，選取高產纖維素酶菌株。

1.3.7 纖維素酶活測定[26-28]

濾紙酶活測定：裁剪定性濾紙條（1 cm×6 cm）置于試管中，加入50 mmol/L、檸檬酸緩沖液（pH 4.8）1.50 mL和粗酶液0.50 mL，用同體積50 mmol/L、檸檬酸緩沖液（pH 4.8）代替粗酶液作為空白對照。在50 ℃水浴中振蕩反應30 min后，加入DNS溶液2 mL，用酶標儀在波長540 nm處測定OD540nm值，根據標準曲線y（OD540nm值）=0.446 8x（葡萄糖含量）+0.043 4（R2=0.999 6）計算葡萄糖含量，并計算濾紙酶活。

外切酶活測定：定量稱取50 mg脫脂棉替代濾紙條作為反應底物，其他步驟同濾紙酶活測定。

內切酶活測定：以CMC-Na作為反應底物，稱取CMC-Na 0.50 g，用50 mmol/L檸檬酸緩沖液（pH 4.8）定容至100 mL獲得CMC-Na溶液，用CMC-Na溶液替代檸檬酸水溶液，其他步驟同濾紙酶活測定。

酶活定義：在上述條件下，1 mL粗酶液每分鐘水解產生1 μmol葡萄糖所需要的酶量為1個酶活力單位（U/mL）。

1.3.8 遺傳穩定性試驗

將篩選出的高產纖維素酶菌株連續傳代培養7次，每代分別制成孢子懸液，按照1%（V/V）的接種量接種到液體產酶培養基中，于30 ℃、180 r/min條件下恒溫振蕩培養4 d，測定每代菌株的纖維素酶活，從而驗證菌株產酶能力的遺傳穩定性[20]。

1.3.9 數據處理及分析

采用Excel 2021對數據進行整理和作圖，用SPSS 26.0軟件對數據進行方差分析。每組實驗平行測定3次，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 最佳紫外誘變時間的確定

在對出發菌株TP-89誘變育種時，菌株的突變率很大程度上受到誘變劑量的影響，誘變劑量越大則突變率越高，但是當達到一定誘變劑量時，繼續加大誘變劑量會導致菌體死亡率過高，誘變效率反而下降[19]。為了獲取理想的誘變效果，以紫外照射時間為變量，對擬康氏木霉菌株TP-89誘變處理后的致死率繪制致死曲線，結果見圖1。

圖1 紫外誘變時間對擬康氏木霉菌株TP-89致死率的影響Fig.1 Effect of UV mutation time on the lethal rate of Trichoderma pseudokoningii TP-89

由圖1可知，隨著誘變時間在0～100 s范圍內的延長，菌株致死率迅速增加，有研究表明，一般選擇菌株致死率在80%～90%范圍內對菌株進行誘變效果較好[19]。當誘變時間為100 s時，菌株致死率為83.8%，誘變時間為120 s時致死率已達98.3%，因此，本實驗選擇100 s為紫外誘變處理的最佳時間。

2.2 最佳ARTP誘變時間的確定

以ARTP誘變時間為變量，對誘變處理后擬康氏木霉菌株TP-89的致死率繪制致死曲線，結果見圖2。

圖2 ARTP誘變時間對擬康氏木霉菌株TP-89致死率的影響Fig.2 Effect of ARTP mutation time on the lethal rate of Trichoderma pseudokoningii TP-89

由圖2可知，隨著誘變時間在0～120 s范圍內的延長，菌株致死率同樣迅速增加，當誘變時間為120 s時，菌株致死率為86.6%，誘變時間＞140 s時，致死率達到100%，按照菌株致死率在80%～90%范圍內進行選擇，選擇120 s為ARTP誘變處理的最佳時間。

2.3 突變菌株的篩選

2.3.1 初篩結果

出發菌株TP-89經UV-ARTP復合誘變后，獲得96株正突變菌株，分別編號為UA-1～UA-96，其中水解圈直徑與菌落直徑比值（H/C）＞2的正突變菌株有6株，結果見表1。

由表1可知，菌株UA-7、UA-33、UA-52、UA-58、UA-67、UA-95的H/C均＞2，分別為2.06、2.05、2.17、2.19、2.47、2.33，因此，選擇這6株突變株進行產酶性能復篩。

2.3.2 復篩結果

對出發菌株TP-89和6株初篩突變菌株的纖維素酶酶活進行測定，結果見圖3。

圖3 出發菌株TP-89及6株突變菌株的濾紙酶活（a）、內切酶活（b）及外切酶活（c）測定結果Fig.3 Determination results of filter paper enzyme activity (a), endonuclide enzyme activity (b), and exonuclide enzyme activity (c) of starting strain TP-89 and 6 mutant strains

由圖3a可知，發酵過程中，出發菌株TP-89和6株突變菌株的濾紙酶活均呈現先增加后下降的趨勢，且均在培養第4天達到酶活的峰值。與出發菌株TP-89相比，5株突變菌株的酶活峰值提高，1株突變菌株的酶活峰值下降，其中突變菌株UA-52和UA-67的最大酶活提高的幅度較大，分別達到了2.41 U/mL和2.59 U/mL，相較于出發菌株TP-89（1.40 U/mL）分別提高了72.1%和85.0%

由圖3b可知，發酵過程中，出發菌株TP-89和6株突變菌株的內切酶活均呈現先升高后下降的趨勢。出發菌株TP-89及突變菌株UA-7、UA-33、UA-52、UA-67、UA-95均在發酵4 d時酶活達到最高，分別為1.89 U/mL、2.35 U/mL、3.43 U/mL、4.53 U/mL、4.26 U/mL和1.69 U/mL；突變菌株UA-58在發酵5 d時，酶活達到最高，為2.34 U/mL。相較于出發菌株，突變菌株UA-33、UA-52、UA-67的最高酶活提高的幅度較大，分別提高了81.5%、139.7%和125.4%。

由圖3c可知，發酵過程中，各菌株的外切酶活均呈現先上升后下降的趨勢，突變菌株UA-58在發酵3 d時，酶活達到最高，為5.11 U/mL；出發菌株TP-89及突變菌株UA-7、UA-33、UA-52、UA-67在發酵4 d時，酶活達到最高，分別為4.58 U/mL、5.12 U/mL、5.98 U/mL、7.43 U/mL、7.79 U/mL；突變菌株UA-95在發酵5 d時，酶活達到最高，為4.01 U/mL。相較于出發菌株TP-89，突變菌株UA-52和UA-67的最高酶活提高的比較明顯，分別提高了62.2%和70.1%。

綜上，突變菌株UA-52和UA-67的濾紙酶活、內切酶活和外切酶活均比出發菌株TP-89得到了明顯的提升，確定為高產纖維素酶的菌株。

2.4 突變菌株遺傳穩定性測定結果

將篩選出的突變菌株UA-52和UA-67連續7次傳代培養，分別培養4 d后測定酶活，結果見表2。

表2 突變菌株UA-52和UA-67遺傳穩定性的測定結果Table 2 Determination results of genetic stability of mutant strains UA-52 and UA-67

由表2可知，突變菌株UA-52在第5代時濾紙酶活和內切酶活顯著下降（P＜0.05），外切酶活在第4代時顯著下降（P＜0.05），說明此突變菌株的遺傳穩定性不夠穩定。而突變菌株UA-67經過7次傳代培養后，濾紙酶活、內切酶活和外切酶活相對初代菌株均無顯著變化（P＞0.05），說明菌株UA-67具有較高的遺傳穩定性。因此，最終篩選突變菌株UA-67為優良的高產纖維素酶菌株，其遺傳穩定性與王豐園等[20]篩選的擬康氏木霉相近，且產酶性能更優。

3 結論

本研究以實驗室保藏的擬康氏木霉（Trichoderma pseudokoningii）菌株TP-89為出發菌株，對其進行UV誘變100 s，ARTP誘變120 s后，獲得96個正突變菌株，經產纖維素酶性能初篩后，發現6株突變菌株的水解圈直徑與菌落直徑比值（H/C）＞2；通過復篩發現，突變菌株UA-52和UA-67的濾紙酶活、內切酶活和外切酶活較出發菌株均得到了明顯的提升。對2株菌株進行連續傳代7次培養后，發現突變菌株UA-67具有較高的遺傳穩定性，其在產酶培養基上培養4d時的濾紙酶活為2.59U/mL、內切酶活為4.26U/mL、外切酶活為7.79 U/mL，較出發菌株TP-89分別提了85.0%、125.4%和70.1%，具有一定工業應用潛力。